Cloning de PCR
Produtos Do Cloning PCR
Se você quiser clone um fragmento do DNA em um plasmid ou em uma construção, uma das maneiras as mais fáceis fazer isto está usando PCR. Se você tiver o fragmento ou o gene do DNA já em um plasmid, e os locais da limitação que flanqueiam o fragmento forem compatíveis com o plasmid que novo você quer clone o em, a digestão do enzyme da limitação trabalha geralmente bem.
Entretanto, se você quiser projetar locais novos da limitação para o fragmento, apagamentos da construção do fragmento, ou locais do mutate dentro do DNA, a reação chain de PCR ou de polymerase do fragmento do DNA é uma das maneiras as mais fáceis e mais melhores clone seu fragmento usando PCR.
Projetando primers para o cloning de PCR
Os primers para o cloning de PCR são geralmente mais longos por causa da necessidade adicionar locais da limitação.
Os locais da limitação são geralmente 6 bp no comprimento. Se você não estiver indo ao subclone o produto de PCR, você necessita adicionar os nucleotides 5' do local da limitação
Isto permite que o enzyme da limitação ligue a e corte o local da limitação para ser mais eficiente.
Seqüência do primer do local da limitação do espaçador (projetada pelo programa mais mais bem vestido)
3 bp -- 6bp -- 15-22 bp
PCR Subcloning
(Subclone significa clone o produto de PCR em um vetor antes que você o introduzir em seu vetor do interesse. As vantagens desta incluem o fato que você nunca tem que PCR sua inserção outra vez, você tê-la-ão sempre no refrigerador, e você pode crescer acima tanto quanto você quer usando as bactérias.)
De nossa experiência, que corta PCR produtos é geralmente muito mais menos eficiente do que fragmentos do corte fora dos vetores. Assim, os produtos cortando de PCR e cloning os em seu vetor diretamente não podem estar que eficiente e você pode ter o problema fazer este.
Aquela é maneira que subcloning em um vetor subcloning é geralmente a mais melhor.
Vetores do Topo
Os vetores do TOPO são grandes para subcloning, embora possam ser caros. Conservá-lo-ão tempo a longo prazo, e fazem produtos do cloning PCR mais fáceis e mais eficientes.
A razão para esta é que você pode fàcilmente digerir o DNA em um plasmid. É mais eficiente para o enzyme da limitação porque pode fàcilmente ligar a e digerir sua parte.
As desvantagens são que você deve ter condições eficientes e optimized de PCR. A presença de muitas faixas em seu PCR far-lhe-á if.not impossível difícil clone seu produto de PCR do interesse.
Você pode geralmente subclone seu produto de PCR dentro de aproximadamente 2 dias. O ligation faz exame de somente 5 minutos e você pode chapear suas colônias bacterianas o dia do ligation. Uma vez que você escolhe as colônias no dia seguinte e as cresce nos meios, você não somente para amplificar sua inserção, você também tem agora uma colônia bacteriana do seu subcloned a inserção que você pode congelar com glycerol no nitrogênio líquido por anos.
Isto ajuda realmente quando você necessita fazer uma outra construção com sua inserção!