Clonagem do PCR
Produtos do PCR do clonagem
Se você quer clonar um fragmento do ADN em um plasmídeo ou em uma construção, uma das maneiras as mais fáceis de fazer isto está usando o PCR. Se você tem o fragmento ou o gene do ADN já em um plasmídeo, e os locais da limitação que flanqueiam o fragmento são compatíveis com o plasmídeo que novo você quer o clonar em, a digestão da enzima da limitação trabalha geralmente bem.
Entretanto, se você quer projetar locais novos da limitação para o fragmento, construir apagamentos do fragmento, ou transformar locais dentro do ADN, o PCR ou a reacção em cadeia do polymerase do fragmento do ADN são uma das maneiras as mais fáceis e melhores de clonar seu fragmento usando o PCR.
Projetando primeiras demão para o clonagem do PCR
As primeiras demão para o clonagem do PCR são geralmente mais longas por causa da necessidade de adicionar locais da limitação.
Os locais da limitação são geralmente 6 bp do comprimento. Se você não está indo ao subclone o produto do PCR, você precisa de adicionar os nucleotides 5 ' do local da limitação
Isto permite que a enzima da limitação ligue a e corte o local da limitação para ser mais eficiente.
Seqüência da primeira demão do local da limitação do espaçador (projetada pelo programa da primeira demão)
3 bp --6bp 15-22 bp
PCR Subcloning
(Subclone significa clonar o produto do PCR em um vetor antes que você o introduzir em seu vetor do interesse. As vantagens desta incluem o fato de que você nunca tem que PCR sua inserção outra vez, você tê-la-ão sempre no refrigerador, e você pode crescer acima tanto quanto você quer usando as bactérias.)
De nossa experiência, cortar produtos do PCR é geralmente muito menos eficiente do que fragmentos do corte fora dos vetores. Assim, cortar produtos do PCR e cloná-los em seu vetor diretamente não podem estar que eficiente e você pode ter o problema fazer este.
Aquela é maneira que subcloning em um vetor subcloning é geralmente a melhor.
Vetores do TOPO
Os vetores do TOPO são grandes para subcloning, embora possam ser caros. Conservá-lo-ão tempo a longo prazo, e fazem produtos do PCR do clonagem mais fáceis e mais eficientes.
A razão para esta é que você pode facilmente digerir o ADN em um plasmídeo. É mais eficiente para a enzima da limitação porque pode facilmente ligar a e digerir sua parte.
As desvantagens são que você deve ter condições eficientes e aperfeiçoadas do PCR. A presença de muitas faixas em seu PCR far-lhe-á se não impossível difícil clonar seu produto do PCR do interesse.
Você pode geralmente subclone seu produto do PCR dentro de aproximadamente 2 dias. A ligadura toma somente 5 minutos e você pode chapear suas colônias bacterianas o dia da ligadura. Uma vez que você escolhe colônias o next day e as cresce nos media, você não somente para amplificar sua inserção, você igualmente tem agora uma colônia bacteriana de sua inserção subcloned que você possa congelar com glicerol no nitrogênio líquido por anos.
Isto ajuda realmente quando você precisa de fazer uma outra construção com sua inserção!