ENZIMAS DO PCR: Polymerases do PCR

Polymerases do PCR - o guia final

Polymerases do PCR: Uma introdução

A escolha do polymerase de ADN empregado pelo PCR é determinada pelos objetivos da experiência. Há agora uma pletora de enzimas disponíveis no comércio a escolher do esse difere em seus estabilidade térmica, processivity, e fidelidade. A enzima a mais de uso geral e o mais extensivamente a mais estudada é polymerase de ADN de Taq.

Polymerases iniciais do PCR

Os polymerases de ADN usados original nas primeiras reações do PCR foram extraídos da bactéria Escherichia Coli. Embora esta enzima fosse uma ferramenta inestimável para muitos usos da pesquisa da biologia molecular no passado e mesmo hoje, teve muitas desvantagens no PCR original. No PCR, a reação do pcr deve ser desnaturada aquecendo o produto double-stranded do ADN após cada ciclo. Infelizmente, aquecendo-se igualmente inactivated irreversìvel o polymerase de ADN de Escherichia Coli. As partes alíquota frescas da enzima tiveram que ser adicionadas manualmente no início de cada ciclo. Com 30-40 ciclos do PCR, esta era uma tarefa muito laboriosa e aborrecida.

O que foi exigido eram um polymerase de ADN que restante estáveis durante a etapa da desnaturação do ADN executada em 90°C ou vibram. Uma descoberta facilitou a solução muito. O aquaticus Thermophilus da bactéria foi isolado das molas quentes da água. Esta bactéria podia sobrevive e proliferate extremamente nas temperaturas do ponto alto das molas quentes. A isolação do polymerase de ADN desta bactéria rendeu um polymerase do PCR que não inactivated ràpida em altas temperaturas. Gelfand e outros no corporaçõ de Cetus com sucesso purified e clonou este Polymerase agora chamado de Taq do polymerase do PCR (aquaticus Thermophilus no short).

Isto reservou 30-40 ciclos da amplificação do PCR a ser executada sem a necessidade de abrir o tubo da reação do PCR e de adicionar o polymerase fresco. Esta contaminação potencial igualmente reduzida que poderia ser introduzida ao adicionar o polymerase manualmente sobre 20-30 cronometra nas reações originais do PCR. Também, devido à natureza da bactéria thermophilic e do polymerase, Taq funcionou óptima em temperaturas em torno de 72°C, permitindo que a síntese do ADN seja executada em muito mais altamente
temperaturas do que era possível com a enzima de Escherichia Coli. Isto teve a vantagem de permitir que a costa do ADN do molde seja copiada em uma fidelidade muito mais elevada devido a um strigency mais elevado do recozimento da primeira demão do PCR. Este produtos não específicos reduzidos mais adicionais que tinham afetado muitas reações mais adiantadas do PCR.

Polymerase de ADN de TAQ

O Polymerase igualmente “Taq simplesmente denominado” de Taq, é um polymerase de ADN thermostable usado na reacção em cadeia do polymerase (PCR) catalisar a reação da réplica do ADN no ciclo do PCR. Desse modo da amplificação, o PCR pode examinar para a presença ou a ausência de um gene do interesse em uma amostra biológica.

Polymerase de ADN de Taq

Modelo molecular do Polymerase de ADN de Taq. A estrutura de cristal do ADN-Polymerase de Taq mostra uma orientação nova para o domínio Estrutura-Específico da nuclease.

O polymerase de ADN de Taq substituiu o Polymerase de ADN de Escherichia Coli no PCR, devido a suas propriedades thermostable. Taq foi isolado primeiramente do aquaticus de Thermus, uma bactéria que vivesse em molas quentes e em respiradouros hydrothermal.

Taq era o primeiro polymerase que podia suportar a desnaturalização condiciona (sobre o °C) 90 exigido durante a ciclagem do PCR.

Taq tem um halflife nzymatic de e em 95°C de aproximadamente 40 Min. Para mais propriedades de Taq, veja a tabela abaixo.

Uma de desvantagens principais dos polymerases de Taq é sua baixa fidelidade da réplica. Porque Taq não tem o exonuclease a 3 ' 5 ' corrigir o mecanismo para substituir uma má combinação acidental na costa recentemente sintetizada do ADN, Taq produz mais erros do que corrigindo polymerases tais como Pfu.

O polymerase de ADN de Taq igualmente é original que produz produtos do PCR com saliências de A (adenina). Isto foi encontrado para ser completamente útil, e explorado para produzir o clonagem de Ta e o clonagem do TOPO (Invitrogen). Estes métodos empregam um vetor do clonagem (ou o plasmídeo) que possua saliências de T (Thymine). Isto permite a ligadura usando o topoisomerase ou a ligase do ADN a ser realizados rapidamente com as saliências de A do produto do PCR

Polymerase de ADN de PFU

O polymerase de ADN de Pfu é uma enzima encontrada no furiosus hyperthermophilic de Pyrococcus do archaeon, onde funciona in vivo para replicate o ADN do organismo. In vitro, Pfu é usado para amplificar rapidamente o ADN na reacção em cadeia do Polymerase, onde a enzima sere a função central de copiar uma costa nova do ADN durante cada etapa da extensão.

A superioridade do polymerase de Pfu a diferença principal entre Pfu e enzimas alternativas é thermostability superior de Pfu e “correcção” das propriedades comparadas a outros polymerases thermostable. Ao contrário do polymerase de ADN de Taq, o polymerase de ADN de Pfu possui o exonuclease a 3 ' 5 ' que corrige a atividade, significando que trabalha sua maneira ao longo do ADN da extremidade aos 3 ' fim 5 ' e corrige erros do nucleotide-misincorporation. Isto significa que os fragmentos polymerase-gerados ADN do PCR de Pfu terão poucos erros do que inserções Taq-geradas do PCR. Em conseqüência, Pfu é mais de uso geral para o clonagem molecular de fragmentos do PCR do que o Taq historicamente popular. Pfu disponível no comércio conduz tipicamente a uma taxa de erro de 1 em 1.3 milhão pares baixos e pode render 2.6% produtos transformados quando 1kb de amplificação fragmenta usando o PCR. Entretanto, Pfu é mais lento e exige tipicamente 1-2 minutos para amplificar 1kb do ADN em 72° C. Usar o polymerase de ADN de Pfu em reações do PCR igualmente conduz aos produtos sem corte-terminados do PCR. O polymerase de ADN de Pfu é daqui superior para as técnicas que exigem a síntese high-fidelity do ADN, mas pode igualmente ser usado conjuntamente com o polymerase de Taq para obter a fidelidade de Pfu com a velocidade da atividade do polymerase de Taq.

História

Os cientistas associaram com a companhia Stratagene de Biotech, baseado em La Jolla, Califórnia descobriram a superioridade de Pfu sobre Taq em 1991. Publicaram seu trabalho no gene do jornal em dezembro desse ano (gene. 1991 dezembro 12; 108 (1): 1-6). E.U.A patente 5.489.523 foi concedida sobre Pfu exonuclease-deficiente em fevereiro 1996 quando a patente 5.545.552 dos E.U. sobre Pfu próprio foi concedida em agosto 1996.

Polymerases do PCR

Sumário de Polymerases disponíveis do PCR e de suas propriedades.

Polymerase de ADN	Fonte biológica	5 '--3 ' Exonuclease Atividade	3 '--5 ' Exonuclease Atividade	Half-life 95°C (minuto)	Nomes comerciais	Companhias de fornecimento	Taxa da extensão (nucleosides/s)	Taxa de erro	Tempo (s) a 1kb (72°C)
Taq	Thermus Aquaticus	+	-	40	AmpliTaq, ouro de AmpliTaq	Promega, Roche, Invitrogen e muito outro.	75	1 em 10^3	32
Pfu	Furiosus de Pyrococcus	-	+	120	PfuTurbo	Stratagene, Fermentas, Invitrogen entre outro	60	1 em 1.3 x 10^6	60-120
Pwo	Woesei de Pyrococcus	-	+	N/A			N/A	N/A	N/A
Tfl	Thermas flavus	-	-
rTth	Themus thermophilus	+	-	20
Tli	Litoris de Thermus	-	+	400	Respiradouro
Tma	Maritima de Thermotoga	-	+	>50

PCR e Polymerases

O PCR foi executado no ADN de 10 kilobases maiores, porém o PCR médio é somente várias centenas a algumas mil bases do ADN. O problema com PCR longo é que há um contrapeso entre a exatidão e o processivity da enzima. Geralmente, mais longo o fragmento, maior a probabilidade de erros.

Tipos de PCR

Recursos do PCR