Pesquisa de defeitos do PCR
Problemas do PCR e soluções, ajuda do PCR
O que é seu problema do PCR?:
Produtos não específicos longos do PCR?
Formação de dímero da primeira demão?
Problema:
Produtos não específicos longos no PCR
Ao funcionar um gel do agarose você mancha as faixas não específicas maiores do PCR que não são as direitas fazem sob medida.
Soluções aos produtos não específicos longos no PCR:
Diminua o tempo de recozimento
Diminua o tempo da extensão
Diminua a temperatura da extensão a 62-68º C
Aumente a concentração do KCl (amortecedor) a 1.2x-2x, mas mantenha a concentração do MgCl2 em 1.5-2mM
Aumente a concentração do MgCl2 até 3-4.5 milímetros mas mantenha a constante da concentração do dNTP.
Use menos primeira demão
Tome menos molde do ADN
Tome menos polymerase de Taq
Se nenhuns dos trabalhos acima: verific a primeira demão para ver se há seqüências repetitivas (a EXPLOSÃO alinha a seqüência com as bases de dados) e mude as primeiras demão
Combinação de algum/todo o acima.
Problema:
Dímero da primeira demão do PCR
Ao funcionar um gel do agarose, você mancha algumas faixas muito pequenas do PCR. Estes são o tamanho de sua primeira demão ou sobre o tamanho de ambas suas primeiras demão (A e B) junto. Estes são denominados da “dímero primeira demão” e dados forma pelo recozimento de sua primeira demão com se ou com a outra primeira demão.
Soluções aos dímero da primeira demão no PCR:
Use menos primeira demão.
A primeira demão do Re-design e requisita um grupo novo. Certifique-se de você software e verificação do projeto da primeira demão do uso para o auto-recozimento e que as primeiras demão não compartilham de uma grande porcentagem da seqüência complementar. Verific primeiras demão com cuidado para ver se há o homo-dímero e a formação de hetero-dímero com o OligoAnalyzer
Conduza o PCR com e sem formamide.
Titrate a concentração de Mg2+ (MgCl - 1.5, 2.0, 2.5 e 3.0 milímetros).
Aumente uma quantidade do molde do ADN (concentração).
Aumente a temperatura do recozimento (tentativa que aperfeiçoa usando uma máquina do PCR do inclinação para encontrar a temperatura óptima para o recozimento).
Tente adicionar DMSO até 5%.
Tente usar o PCR de HotStart em vez do PCR regular do polymerase de Taq.
Combinação de algum/todo o acima.