PCR Que Pesquisa defeitos
Problemas de PCR e soluções, ajuda de PCR
O que é seu problema de PCR?:
Produtos non-specific longos de PCR?
Formação de dimer mais maia bem vestido?
Produtos non-Specific longos em PCR
Ao funcionar um gel do agarose você mancha as faixas non-specific maiores de PCR que não são as direitas fazem sob medida.
Soluções a long produtos non-specific em PCR:
Diminua o tempo de recozimento
Diminua o tempo da extensão
Diminua a temperatura da extensão a 62-68º C
Aumente a concentração do kCl (amortecedor) a 1.2x-2x, mas mantenha a concentração do mgCl2 em 1.5-2mM
Aumente a concentração do mgCl2 até 3-4.5 milímetros mas mantenha a constante da concentração do dNTP.
Use menos primer
Faça exame de menos molde do DNA
Faça exame de menos polymerase de Taq
Se nenhuns dos trabalhos acima: verifique o primer para ver se há seqüências repetitivas (a EXPLOSÃO alinha a seqüência com as bases de dados) e mude o primer(s)
Combinação de some/all do acima.
Problema:
Dimers Do Primer de PCR
Ao funcionar um gel do agarose, você mancha algumas faixas muito pequenas de PCR. Estes são o tamanho de seu primer ou sobre o tamanho de ambos seus primers (A e B) junto. Estes são denominados "uns dimers mais maiss bem vestido" e dados forma pelo recozimento de seu primer com se ou com o outro primer.
Soluções aos dimers mais maiss bem vestido em PCR:
Use menos primer.
O primer do re-design e requisita um grupo novo. Certifica-se você software e verificação do projeto do primer do uso para o self-recozimento e que os primers não compartilham de uma porcentagem grande da seqüência complementar. Verifique primers com cuidado para ver se há a formação de homo-homo-dimer e de hetero-hetero-dimer com o OligoAnalyzer
Conduza PCR com e sem formamide.
Titrate a concentração de Mg2+ (MgCl - 1.5, 2.0, 2.5 e 3.0 milímetro).
Aumente uma quantidade do molde do DNA (concentração).
Aumente a temperatura do recozimento (tentativa que optimizing usando uma máquina do gradient PCR encontrar a temperatura optimal para o recozimento).
Tente adicionar DMSO até 5%.
Tente usar HotStart PCR em vez do polymerase regular PCR de Taq.
Combinação de some/all do acima.