RT-PCR
Inverta A Reação Chain Do Polymerase Da Transcrição
A reação chain do polymerase reverso da transcrição (RT-PCR) é baseada na reação chain do polymerase (PCR). É baseada mais importante no processo da transcrição reversa, que o reverso transcreve o RNA no DNA e foi isolado inicialmente dos retroviruses.
As técnicas de RT-PCR permitem a formação do DNA (complementar ou do DNA da cópia) do RNA, que armazena a seqüência do RNA (tal como o RNA, o mRNA do mensageiro) no formulário mais estável do ácido nucleic, DNA. Esta transcrição reversa do RNA em seu DNA reverso do complemento (DNA) é a primeira etapa de um processo geralmente two-step de RT-PCR. Além disso, copí o RNA no DNA, um pode então amplificar a seqüência do DNA usando os primers específicos para a seqüência do DNA. Este amplification é a segunda etapa principal final do processo two-step de RT-PCR.
O processo de RT-PCR
A primeira etapa de RT-PCR é consultada a como a "primeira reação da costa". Na reação da primeiro-costa, o DNA também denominado complementar do DNA, é feito do molde do RNA do mensageiro do interesse usando o descolamento do oligo (ato poly-dTs-dTs similar aos primers e ao ligamento ' seqüência do polyA aos 3 situada no 3' UTR - região untranslated, que estão atuais em a maioria de mRNAs), dNTPs do oligonucleotide, e um polymerase RNA-dependente do DNA, inverte o transcriptase, com o processo da transcrição reversa.
Estes fatores são combinados em um amortecedor reverso do transcriptase para 1 hora em 37°C. Depois que a reação reversa do transcriptase está completa, e o DNA synthesized, RNaseH está adicionado (um enzyme da digestão do RNA) que digere o RNA away do híbrido RNA-RNA-DNA. Após o incubation com RNaseH, a reação chain padrão de PCR ou de polymerase é conduzida usando os primers do oligo do DNA específicos para a seqüência do interesse. Esta segunda etapa é consultada como à "segunda reação da costa".
Assim adicionando o polymerase thermostable do DNA, os primers rio acima e downstream do DNA, o único DNA encalhado transformam-se dobro encalhado e são amplificados, permitindo a deteção de seqüências raras ou baixas uniformes do mRNA da cópia amplificando seu DNA complementar.
Aplicações de RT-PCR
O amplification exponencial da seqüência complementar do mRNA ou as seqüências do RNA através da reação chain do polymerase reverso da transcrição permitem uma técnica elevada da deteção da sensibilidade, onde o número baixo da cópia ou as moléculas mais menos abundantes do RNA possam ser detectados. É usado também clone seqüências do mRNA no formulário do DNA complementar, permitindo que as bibliotecas de DNA (bibliotecas do DNA) sejam criadas que contêm todas as seqüências do mRNA dos genes expressados em uma pilha. Além disso, permite a criação das construções do DNA que cloned por RT-PCR e permitem a expressão dos genes nos níveis do RNA e da proteína para um estudo mais adicional.