RT-PCR
Inverta a reacção em cadeia do Polymerase da transcrição
A reacção em cadeia reversa do polymerase da transcrição (RT-PCR) é baseada na reacção em cadeia do polymerase (PCR). É baseada mais importante no processo de transcrição reversa, que o reverso transcreve o RNA no ADN e foi isolado inicialmente dos retroviruses.
As técnicas de RT-PCR permitem a formação de cDNA (complementar ou de ADN da cópia) do RNA, que armazena a seqüência do RNA (tal como o RNA de mensageiro, mRNA) no formulário mais estável do ácido nucleico, ADN. Esta transcrição reversa do RNA em seu ADN reverso do complemento (cDNA) é a primeira etapa de um processo geralmente two-step de RT-PCR. Além disso, copiando o RNA no ADN, um pode então amplificar a seqüência do cDNA usando as primeiras demão específicas para a seqüência do ADN. Esta amplificação é a segunda etapa principal final do processo two-step de RT-PCR.
O processo de RT-PCR
A primeira etapa de RT-PCR é referida como a “primeira reação da costa”. Na reação da primeiro-costa, o cDNA igualmente denominado complementar do ADN, é feito do molde do RNA de mensageiro do interesse usando o descolamento oligo (ato poli-dTs similar às primeiras demão e ao ligamento aos 3 ' seqüência situada nos 3 ' UTR - região untranslated do polyA, que estão atuais em a maioria de mRNAs), dNTPs do oligonucleotide, e um polymerase de ADN RNA-dependente, inverte o transcriptase, com o processo de transcrição reversa.
Estes fatores são combinados em um amortecedor reverso do transcriptase para 1 hora em 37°C. Depois que a reação reversa do transcriptase está completa, e o cDNA estêve sintetizado, RNaseH está adicionado (uma enzima da digestão do RNA) que digere o RNA longe do híbrido do RNA-cDNA. Após a incubação com RNaseH, o PCR ou a reacção em cadeia padrão do polymerase são conduzidos usando as primeiras demão oligo do ADN específicas para a seqüência do interesse. Esta segunda etapa é referida como a “segunda reação da costa”.
Assim adicionando o polymerase de ADN thermostable, as primeiras demão rio acima e a jusante do ADN, o único ADN encalhado transformam-se dobro encalhado e são amplificadas, permitindo a deteção de mesmo seqüências raras ou baixas do mRNA da cópia amplificando seu ADN complementar.
Aplicações de RT-PCR
A amplificação exponencial da seqüência complementar do mRNA ou as seqüências do RNA através da reacção em cadeia reversa do polymerase da transcrição permitem uma técnica elevada da deteção da sensibilidade, onde o baixo número de cópia ou as moléculas menos abundantes do RNA possam ser detectados. É usado igualmente para clonar seqüências do mRNA sob a forma do ADN complementar, permitindo que as bibliotecas do cDNA (bibliotecas do cDNA) sejam criadas que contêm todas as seqüências do mRNA dos genes expressados em uma pilha. Além disso, permite a criação das construções do cDNA que foram clonadas por RT-PCR e permitem a expressão dos genes a níveis do RNA e da proteína para um estudo mais adicional.