В PCR Situ
Определение в PCR Situ
В PCR Situ (ISH) цепная реакция полимеразы которая фактически осуществляет внутри клетки на скольжении. В PCR situ амплификацию можно выполнить на фикчированных ткани или клетках.
В введении PCR Situ
Во время начала и прогрессирования заболевания, мельчайшие количества продукта в малых населенностях клеток или ткани могут быть существены для патогенеза заболевания.
В много медленн-эволюционируя заболеваний которые требуют месяцев или даже лет для того чтобы обнародовать клинически, было показано что большинство affected населенности клетки в transcriptionally бездействующем положении, и на уровне одного гена в ведущую ячейку.
Были использованы методы гибридизации нуклеиновой кислоты и цепная реакция полимеразы (PCR) оба рассмотреть выражение и обнаружение таких affected генов во время патогенеза. Пока оба этих метода довольно полезны, недостаток этих методов что они существенно дирижируют изучения выражения и населенности клетки. Нуклеиновые кислоты изолированы от населенности клеток которая содержит или достаточный количество молекул для того чтобы обнаружить сразу стандартными методами гибридизации, или, когда субпопуляция содержит как немногую как одиночный экземпляр нуклеиновой кислоты, той молекулы усиленной PCR, и обнаруженной после амплификации.
В гибридизации situ (ISH) прикладывает методологию метода гибридизации нуклеиновой кислоты к клетчатому уровню. Совмещать cytochemistry и immunocytochemistry, в PCR Situ позволяет идентификации клетчатых отметок быть определенным, и более добавочно позволяет локализацию к последовательностей клетки специфических внутри населенности клетки, как ткани и пробы крови.
В Situ PCR ограничен к обнаружению non-genomic материала как RNA, гены или геномы, по мере того как предел обнаружения в большинств условиях несколько экземпляров кислоты цели нуклеиновой в клетку. Поэтому, должно к ограничениям номера экземпляра, гибридизации RNA более чувствительн чем обнаружение дна.
Факторы влияя на в чувствительности PCR Situ включают:
1) strandedness молекулы цели
2) отсутсвие комплементарной последовательности проксимальной к последовательностям цели
Обратите transcriptase-катализировано в транскрипции situ даже использует для того чтобы обнаружить RNAs которые происходят на относительно высоком номере экземпляра.
В PCR Situ (ISH) Protcol
Первоначально стехиометричность компонентов нуклеиновой кислоты делает праймер-управляемую реакцию. По мере того как реакция продолжает однако, продукт сам PCR начинает действовать как цель для более дальнеишей амплификации, также, как праймер для более дальнеишей удлиненности. Накопление последовательностей вытянутых в множественных реакциях которое сохранено фикчированной клеткой и действует как цель для radiolabeled зонда в участке обнаружения.
Сложная физическая природа внутри фикчированная клетка препятствует и эффективность полимеразы также, как диффузия и отжиг, и таким образом времена удлиненности гораздо длиннее чем времдирижированные под водяными условиями (стандартный PCR). Оптимальный сигнал обычно producted используя мельчайшую удлиненность 15.