Discovery of PCR Открытие ПЦР
Inventor of PCR Изобретатель из PCR
PCR , or Polymerase Chain Reaction was first popularly thought to have been conceived by Dr. Kerry Mullis in 1983 while working at the Cetus Corporation in Emeryville, CA, along with other researchers at Cetus Corporation. Cetus Corporation discovered a method to start and stop DNA polymerase enzyme activity at specific points along a single strand of DNA. On the other hand, some pioneering research was also done by Gobind Khorana, who described a basic principle of replicating a piece of DNA using two primers (1971). Kerry Mullis discovered that by harnessing this component of molecular reproduction technology, a target DNA of interest could be amplified exponentially. This DNA amplification procedure was an in vitro process (meaning in a test-tube). ПЦР, или полимеразной цепной реакции была впервые всенародно полагают, были разработаны доктором Керри Mullis в 1983 году, работая в корпорации Кит в Emeryville, CA, наряду с другими исследователями на Кит корпорации. Кит корпорации обнаружили метод для запуска и остановки ДНК полимеразной активности фермента в конкретных точках вдоль одной пряди ДНК. С другой стороны, некоторые первопроходца исследований было также сделано на Gobind Khorana, которые описаны основные принципы воспроизведения фрагмента ДНК с использованием двух грунтовки (1971). Керри Mullis обнаружил, что по использованию этого компонента воспроизведение молекулярных технологий, целевой ДНК может быть интерес усиливается в геометрической прогрессии. амплификации ДНК Эта процедура была в пробирке процесса (т.е. в пробирке).
Cell-free DNA amplification by PCR was able to simplify many of the standard procedures for DNA cloning, DNA analysis, and the modification of DNA. Previous molecular biology techniques for isolating a specific piece of DNA had relied on gene cloning, which is a tedious and slow procedure. PCR, as Kerry Mullis stated “lets you pick the piece of DNA you’re interested in and have as much of it as you want”. Ячейка свободной амплификации ДНК методом ПЦР удалось упростить многие из стандартных процедур для клонирования ДНК, ДНК-анализ и модификацию ДНК. Предыдущая методов молекулярной биологии для изоляции конкретный образец ДНК полагался на клонирование гена, который является утомительным и медленным процедуру. PCR, как Керри Mullis заявил, что "позволяет выбрать фрагмент ДНК Вас интересуют, и как много она, как вы хотите".
Progress for the development was initially limited by primer synthesis and polymerase purification issues. When Cetus scientists eventually succeeded in making the polymerase chain reaction perform as desired in a reliable fashion, they had an immensely powerful technique for providing almost unlimited quantities of the precise genetic material molecular biologists and others required for their research. Since the first report in1985, more than 5000 scientific papers were published by 1992. Прогресс в интересах развития, первоначально была ограничена первый синтез и очистка полимеразы вопросов. Когда Кит ученых, в конечном итоге удалось сделать полимеразной цепной реакции, как выполнить желаемое на надежной основе, они были чрезвычайно мощным методом для обеспечения практически неограниченным количеством точных генетических материалов молекулярных биологов и других, необходимых для их исследования. С первым докладом in1985, более 5000 научных статей были опубликованы в 1992 году.
Kerry Mullis's PCR Idea Керри Mullis в PCR идея
In Mullis’s head, the discovery grew from a theoretical scheme to perform limited dideoxynucleotide sequencing of unique human genes using synthetic oligonucleotides for the purpose of diagnosing common human disease mutations. An obvious obstacle to such a direct sequencing strategy was the high complexity of the human genome (3.3 X 10^9 base pairs). Therefore, a second oligonucleotide or primer was added to block the progression of the synthesis of the first primer. Later in his thinking however, the second primer was included to bind to the other DNA strand, so that each strand of the mutant allele would contribute to the eventual signal. If the scheme involving simultaneous hybridization of primers to each strand was changed by heating the mixture and then repeating the annealing and extension steps, then the primary signal would be increased even more. Repetition of the steps would allow the products of the first cycle to be duplicated in the second cycle, to yield two copies. Repeating the steps in the cycle again would result in four copies, et cetera . В Mullis голову, открытие выросла с теоретической схемы выполнять ограниченный dideoxynucleotide последовательности уникальных человеческих генов, используя синтетические олигонуклеотиды для общей диагностики заболеваний человека мутации. Очевидным препятствием для такого прямого секвенирования стратегия была высокой сложности генома человека (3,3 х 10 ^ 9 базовых пар). Таким образом, второй или первый oligonucleotide был добавлен блок прогрессии синтезе из первых первый. Позднее, в своем мышлении Однако, второй грунтом была включена обязывать к другим ДНК пряди, так что каждый шлейф мутант аллель будет способствовать в конечном итоге сигнал. Если схема с участием одновременного гибридизации праймеров к каждой пряди был изменен путем нагревания смеси, а затем повторить отжига и продления действия, а затем основного сигнала будет увеличена даже больше. Повторение шагов позволит продукты первой ступени быть продублированы во второй цикл, чтобы принести в двух экземплярах. Повторение шагов в цикле снова приведет в четырех экземплярах, и так далее.
Several weeks passed before this great idea was even attempted at the company labs. Eventually, two oligonucleotide primers were synthesized to be perfectly complementary to each end of the 110 base pair region of a cloned segment of the human beta-globin gene, the amplification was performed, and the DNA products were identified by acrylamide gel electrophoresis. The end result was the anticipated 110 base pair DNA fragment, and the beginning of PCR as a basic technique in molecular biology. Несколько недель прошло, прежде чем эта великая идея была даже попытка компании на лабораторные работы. В конце концов, два oligonucleotide грунтовки были синтезированы быть идеально дополняют друг конца 110 базовых пар региона клонированный сегмент человека бета-глобин гена, усилители был выполняется, и ДНК-продуктов, были определены акриламид гель-электрофорез. Конечный результат был ожидаемым 110 базовых пар ДНК фрагмент, и в начале ПЦР в качестве основного метода в молекулярной биологии.
Initial Problems With PCR Первоначальные проблемы с PCR
In Mullis's original PCR process, the enzyme was used in vitro . В Mullis оригинальные ПЦР процесса фермент был использован в пробирке. The double-stranded DNA was separated into two single strands of DNA by heating it to 96°C. Дважды была мель ДНК, разделенных на две нити одного из ДНК путем нагрева ее до 96 ° C. At this temperature, however, the E.Coli DNA polymerase was destroyed, so that the enzyme had to be replenished with new fresh enzyme after the heating stage of each cycle. На этой температуры, однако, E. Coli ДНК-полимеразы был разрушен, так что фермент должен быть пополнен с новыми свежими фермента после нагрева этапе каждого цикла. Mullis's original PCR process was very inefficient since it required a great deal of time, vast amounts of DNA-Polymerase, and continual attention throughout the PCR process. Mullis оригинальные ПЦР процесс был весьма неэффективно, поскольку для этого требуется много времени, огромного количества ДНК-полимеразы, и постоянное внимание всей ПЦР процесса. Other researchers and companies had to greatly improve the technology and enzymes with the result that PCR now is home to hundreds if not thousands of companies and research institutes which work on improving PCR quality, fidelity, and the processivity of PCR (the length of DNA that can be amplified). Другие исследователи и компании пришлось существенно улучшить технологию и ферментов, в результате чего в настоящее время ПЦР является домом для сотен, если не тысячи компаний и исследовательских институтов, которые работают на улучшение качества ПЦР, верность, и processivity на ПЦР (длина ДНК, что можно расширить).