Ыборка PCR
Предпосылка Ыборкы PCR
Вообще, больше вы первоначально оптимизируете ваше PCR, более менее будет вашей потребностью для stringent методов ыборкы post-PCR.
Если ваши условия PCR наилучшим образом оптимизированы, то большая часть из ваших добавленных праймеров и воли dNTP's была использована вверх во время амплификаций pcr, таким образом будет только очень немногие мешая факторы и может быть по возможности унести сразу sequencing. Если вы идете, то суб-kloniru1te вашу часть PCR в вектор клонирования topo, тогда вы иметь только одну главную полосу PCR видимую на вашем геле. Если вы имеете множественные полосы, то make sure вы оптимизировать ваши условия PCR сперва.
Также см., что продукт PCR sequencing и оптимизирует PCR.
Порекомендованы, что очищают продукты PCR быть очищенным перед sequencing однако для того чтобы получить точные sequencing данные, его обычно вверх по вашим продуктам PCR после амплификации.
Если вы добавляли чрезмерно количество праймера или праймеры unused, то эти праймеры могут подействовать как праймеры выдвижения во время sequencing, resulting in поколение дополнительного комплекта красить-oboznacennyx sequencing частей которые могут сделать sequencing толкование данных трудная if not невозможная.
prducts Столб-yborky PCR следует побежать на геле агарозы для того чтобы рассмотреть качество очищения. Если мазать или множественные полосы присутствуют, то мазок продуктов, вы не будете обычно данные по последовательности высокого качества obatin.
Очищение геля части можно выполнить использующ низкую агарозу плавить-temperatury. Вы можете извлечь вашу полосу под ультрафиолетовым светом с бритвой, и извлекаете ДНАО от ломтика использующ методы извлечения electroelution или геля использующ буфера/колонки.
Ыборка PCR для sequencing и клонировать
Для того чтобы извлечь сверхнормальные dNTPs, unincorporated праймеры, и неспецифичные продукты PCR, котор вы можете использовать несколько методов.
Набор очищения Qiagen PCR и другие наборы ыборкы PCR.
Вы можете также извлечь праймеры и dNTPs путем бежать продукты PCR на агарозе gel, резать полосы вне и дирижировать извлечение ДНАА от геля агарозы использующ набор очищения геля Qiagen.
После Ыборкы PCR
После любого метода clean-up PCR, вы должны установить качество и количество продукта PCR. Вы можете сделать это путем бежать образцы использующ electrophoreiss геля агарозы вместе с отметкой концентрации ДНАА.
Вы можете также оценить количество ДНАА использующ UV спектрофотометр.