Клонирование PCR
Продукты Клонирования PCR
Если вы хотите клонировать часть ДНАА в плазмиду или стройку, то одна из самых легких дорог сделать это использует PCR. Если вы имеете часть или ген ДНАА уже в плазмиде, и места ограничения фланкируя часть совместимы с новой плазмидой, котор вы хотите клонировать их в, пищеварение энзима ограничения обычно работает наилучшим образом.
Однако, если вы хотите проектировать новые места ограничения для части, пропусканий стройки части, или мест mutate внутри ДНАО, то цепная реакция PCR или полимеразы части ДНАА одной из самых легких и самых лучших дорог клонировать вашу часть использующ PCR.
Конструировать праймеры для клонирования PCR
Праймеры для клонирования PCR обычно более длинни из-за потребности добавить места ограничения.
Места ограничения обычно 6 bp в длине. Если вы не идете к subclone продукт PCR, то вы добавить нуклеотиды 5' места ограничения
Это позволяет энзим ограничения связать к и отрезать место ограничения для того чтобы быть эффективне.
Последовательность праймера места ограничения прокладки (конструированная более primer программой)
3 bp -- 6bp -- 15-22 bp
PCR Subcloning
(Subclone намеревается клонировать продукт PCR в вектор прежде чем вы вводите их в ваш вектор интереса. Преимущества этого вклюают факт что вы никогда PCR ваша вставка снова, вы всегда будут иметь ее в холодильнике, и вы можете вырасти вверх как много по мере того как вы хотите использующ бактерии.)
От нашего опыта, режа PCR продукты обычно очень более менее эффективно чем части вырезывания из векторов. Таким образом, режа продукты PCR и клонировать их в ваш вектор сразу не могут быть которому эффективно и вам можете иметь тревогу сделать это.
То будет дорога subcloning в subcloning вектор обычно самый лучший.
Векторы Topo
Векторы topo больш для subcloning, хотя они могут быть дорогими. Они сохранят вас время in the long run, и делают продукты клонирования PCR более легким и более эффективным.
Причина для этого что вы можете легко усвоить ДНАО в плазмиде. Она эффективне для энзима ограничения по мере того как она может легко связать к и усвоить вашу часть.
Недостатки что вы должны иметь эффективные и оптимизированные условия PCR. Присутсвие много полос в вашем PCR сделает им трудная if not невозможную для того чтобы клонировать ваш продукт PCR интереса.
Вы можете обычно subclone ваш продукт PCR within about 2 дня. Перешнуровка требует только 5 минут и вы можете покрыть ваши бактериальные колонии день перешнуровки. Как только вы выберете колонии на следующий день и вырастете они в средствах, вы not only усиливаете вашу вставку, вас также теперь имеете бактериальную колонию вашего subcloned вставка которая вы можете замерзнуть с глицеролом в жидкий азот на леты.
Это реально помогает когда вы сделать другую стройку с вашей вставкой!