Клонирование PCR
Продукты PCR клонирования
Если вы хотите клонировать часть дна в плазмиду или стройку, то один из самых легких путей сделать это использует PCR. Если вы имеете часть или ген дна уже в плазмиде, и места ограничения фланкируя часть совместимы с новой плазмидой, то вы хотите клонировать ее в, пищеварение энзима ограничения обычно работает наилучшим образом.
Однако, если вы хотите проектировать новые места ограничения для части, построить пропускания части, или видоизменить места внутри дна, то PCR или цепная реакция полимеразы части дна один из самых легких и самых лучших путей клонировать вашу часть используя PCR.
Конструировать праймеры для клонирования PCR
Праймеры для клонирования PCR обычно более длинни из-за потребности добавить места ограничения.
Места ограничения обычно 6 bp в длине. Если вы не идете к subclone продукт PCR, то вам нужно добавить нуклеотиды 5 ' места ограничения
Это позволяет энзиму ограничения связать к и отрезать место ограничения для того чтобы быть эффективне.
Последовательность праймера места ограничения прокладки (конструированная программой праймера)
3 bp --6bp 15-22 bp
PCR Subcloning
(Subclone значит клонировать продукт PCR в вектор прежде чем вы вводите его в ваш вектор интереса. Преимущества этого включают факт что вы никогда PCR ваша вставка снова, вы всегда будут иметь ее в холодильнике, и вы можете вырасти вверх как много по мере того как вы хотите использующ бактерии.)
От нашего опыта, резать продукты PCR обычно очень более менее эффективн чем части вырезывания из векторов. Таким образом, резать продукты PCR и клонировать их в ваш вектор сразу не могут быть которому эффективно и вам можете иметь тревогу сделать это.
То путь subcloning в subcloning вектор обычно само лучше.
Векторы TOPO
Векторы TOPO больш для subcloning, хотя они могут быть дорогими. Они сохранят вас время в дальнего прицела, и делают продукты PCR клонирования более легким и более эффективным.
Причина для этого что вы можете легко усвоить дна в плазмиде. Она эффективне для энзима ограничения по мере того как она может легко связать к и усвоить вашу часть.
Недостатки что вы должны иметь эффективные и оптимизированные условия PCR. Присутсвие много диапазонов в вашем PCR сделает его трудным если не невозможно для того чтобы клонировать ваш продукт PCR интереса.
Вы можете обычно subclone ваш продукт PCR в пределах около 2 дней. Перешнуровка требует только 5 минут и вы можете покрыть ваши бактериальные колонии день перешнуровки. Как только вы выбираете колонии на другой день и растете они в средствах, вы не только усилить вашу вставку, вас также теперь имеете бактериальную колонию вашей subcloned вставки которая вы можете замерзнуть с глицеролом в жидкий азот на леты.
Это действительно помогает когда вам нужно сделать другую стройку с вашей вставкой!