ЭНЗИМЫ PCR: Полимеразы PCR

Полимеразы PCR - типичный направляющий выступ

СТАНЦИЯ 2006 PCR авторского права

Полимеразы PCR: Введение

Выбор полимеразы дна используемой PCR определен целями эксперимента. Теперь избыток имеющих на рынке энзимов, котор нужно выбрать от того отличают в их термальной стабилности, processivity, и точности воспроизведения. Наиболее обыкновеннообщ используемый и само обширно изучаемый энзим полимераза дна Taq.

Начальные полимеразы PCR

Полимеразы дна используемые первоначально в первых реакциях PCR были извлечены от бактерии Escherichia Coli. Хотя этот энзим был неоцененным инструментом для много польз исследования молекулярной биологии в прошлом и даже сегодня, он имел много недостатков в первоначально PCR. В PCR, реакция pcr должна быть денатурирована путем нагревать double-stranded продукт дна после каждого цикла. Несчастливо, нагрюющ также irreversibly деактивировал полимеразу дна Escherichia Coli. Свежие аликвоты энзима должны быть добавлены вручную в начале каждого цикла. С 30-40 циклами PCR, это была очень трудный и сверлильной задачей.

Что необходимо было полимеразой дна что о стабилизированы во время шага denaturation дна выполненного на 90°C или hotter. Открытие сделало разрешение гораздо легке. Aquaticus бактерии Thermophilus было изолировано от весен воды горячих. Эта бактерия могла выдерживает и пролиферирует в весьма температурах прилива горячих весен. Изоляция полимеразы дна от этой бактерии произвела полимеразу PCR которая быстро не была деактивирована в условиях высоких температур. Gelfand et al. на корпорации Cetus успешно очистили и клонировали эту полимеразу Taq полимеразы PCR теперь вызванную (Thermophilus aquaticus вкратце).

Это позволило 30-40 циклам амплификации PCR, котор нужно выполнить без потребности раскрыть пробку реакции PCR и добавить свежую полимеразу. Это также уменьшенное потенциальное загрязнение которое смогло быть введено добавляя полимеразу вручную над 20-30 приурочивает в первоначально реакциях PCR. Также, должно к природе термофильной бактерии и полимеразы, Taq задействовал оптимально на температурах вокруг 72°C, позволяющ синтезу дна быть выполненным на очень более высоко
температуры чем было возможен с энзимом Escherichia Coli. Это имело преимущество позволять стренге дна шаблона быть скопированным на гораздо точнее должный к более высокому strigency отжига праймера PCR. Эт более новые уменьшенные неспецифичные продукты которые повлияли на много более предыдущих реакций PCR.

Полимераза дна TAQ

Полимераза также просто термин «Taq» Taq, термостабильная полимераза дна используемая в цепной реакции полимеразы (PCR) катализировать реакцию репликации дна в цикле PCR. Таким образом амплификации, PCR могл рассмотреть для присутсвия или отсутствия гена интереса в биологическом образце.

Полимераза дна Taq

Молекулярная модель полимеразы дна Taq. Кристаллическая структура Дна-Полимеразы Taq показывает новую ориентацию для Структур-Специфического домена нуклеиназы.

Полимераза дна Taq заменила полимеразу дна Escherichia Coli в PCR, должном к своим термостабильным свойствам. Taq сперва было изолировано от aquaticus Thermus, бактерии которая живет в горячих веснах и гидротермических сбросах.

Taq было первой полимеразой которая могла выдержать денатурируя условия (над °C 90) необходимо во время задействовать PCR.

Taq имеет полувыведение e nzymatic на 95°C около 40 MIN. Для больше свойств Taq, см. таблицу ниже.

Один из недостатков полимераз Taq главных своя низкая точность воспроизведения репликации. По мере того как Taq не имеет exonuclease 3 ' до 5 ' proofreading механизм для того чтобы заменить случайное рассогласование в заново синтезированной стренге дна, Taq производит больше ошибок чем proofreading полимеразы как Pfu.

Полимераза дна Taq также уникально в что она производит продукты PCR с свисаниями a (аденина). Это было найдены, что было довольно полезно, и было эксплуатировано для того чтобы произвести клонирование TA и клонирование TOPO (Invitrogen). Эти методы используют вектор клонирования (или плазмиду) который обладает свисаниями t (Thymine). Это позволяет перешнуровке используя topoisomerase или лигазу дна быстро, котор нужно выполнить с свисаниями a продукта PCR

Полимераза дна PFU

Полимераза дна Pfu энзим найденный в hyperthermophilic furiosus Pyrococcus archaeon, где она действует внутри - vivo для того чтобы скопировать дна организма. В vitro, Pfu использовано быстро для того чтобы усилить дна в цепной реакции полимеразы, где энзим служит центральная функция копировать новую стренгу дна во время каждого шага выдвижения.

Превосходство полимеразы Pfu главным образом разница между Pfu и альтернативными энзимами термоустойчивость Pfu главная и «proofreading» свойства сравненные к другим термостабильным полимеразам. Не похоже на полимеразе дна Taq, полимераза дна Pfu обладает exonuclease 3 ' до 5 ' proofreading деятельность, что она работает свой путь вдоль дна от конца 3 ' конец до 5 ' и исправляет ошибки нуклеотида-misincorporation. Это значит что части PCR Pfu полимераз-произведенные дна будут иметь немногие ошибки чем Taq-произведенные вставки PCR. В результате, Pfu более обыкновенно использовано для молекулярного клонирования частей PCR чем исторически популярное Taq. Имеющее на рынке Pfu типично приводит к в частоте повторения ошибок 1 в 1.3 миллиона низкопробных парах и может произвести 2.6% видоизмененных продукта усиливая части 1kb используя PCR. Однако, Pfu более медленно и типично требует 1-2 минут для того чтобы усилить 1kb дна на C. 72°. Используя Pfu полимераза дна в реакциях PCR также приводит к в туп-законченных продуктах PCR. Полимераза дна Pfu следовательно главный начальник для методов которые требуют высококачественного синтеза дна, но может также быть использована совместно с полимеразой Taq для того чтобы получить точность воспроизведения Pfu с скоростью деятельности при полимеразы Taq.

История

Научные работники связали с компанией Stratagene biotech, основанным в La Jolla, Калифорния открыли превосходство Pfu над Taq в 1991. Они опубликовали их работу в журнале Джин в декабрь того года (Джин. 12-ое декабря 1991; 108 (1): 1-6). США Патент 5.489.523 был над exonuclease-недостаточным Pfu в феврале 1996 пока патент 5.545.552 США над Pfu самим был в августе 1996.

Полимеразы PCR

Сводка имеющихся полимераз PCR и их свойств.

Полимераза дна	Биологический источник	5 '--3 ' Exonuclease Деятельность	3 '--5 ' Exonuclease Деятельность	полувыведение 95°C (минута)	Коммерчески имена	Поставляя компании	Тариф выдвижения (nucleosides/s)	Частота повторения ошибок	Время (s) к 1kb (72°C)
Taq	Thermus Aquaticus	+	-	40	AmpliTaq, золото AmpliTaq	Promega, Roche, Invitrogen и много других.	75	1 в 10^3	32
Pfu	Furiosus Pyrococcus	-	+	120	PfuTurbo	Stratagene, Fermentas, Invitrogen среди других	60	1 в 1.3 x 10^6	60-120
Pwo	Woesei Pyrococcus	-	+	N/A			N/A	N/A	N/A
Tfl	Thermas flavus	-	-
rTth	Themus thermophilus	+	-	20
Tli	Litoris Thermus	-	+	400	Сброс
Tma	Maritima Thermotoga	-	+	>50

PCR и полимеразы

PCR был выполнен на дна более большие чем 10 kilobases, тем ме менее средний PCR только нескольк 100 к немного тысячи оснований дна. Проблема с длинним PCR что баланс между точностью и processivity энзима. Обычно, длинне часть, больш вероятность ошибок.

Справки полимераз PCR