PCR Product Sequencing ПЦР продукта последовательности
How To Sequence Your PCR Products Как последовательность ваших продуктов ПЦР
Once you amplify your DNA sequence of interest, you usually need to check the amplification quality and accuracy using DNA sequencing services. После того как вы расширить вашу ДНК, представляющие интерес, вы, как правило, необходимо проверить, усиление качества и точности с помощью секвенирования ДНК услуг. There are several methods to do this and each method has its advantages and disadvantages. Есть несколько способов это сделать, и каждый метод имеет свои преимущества и недостатки.
Direct Sequencing of PCR Products Прямое секвенирование ПЦР продукты
Direct sequencing of PCR products is obviously the quickest method although it is not always the most successful method. Прямое секвенирование ПЦР продуктов, безусловно, самый быстрый метод, хотя она не всегда является наиболее успешным методом. It is possible to directly sequence a PCR product without having first cloned the fragment into a sub-cloning vector such as a TOPO plasmid. Вполне возможно, непосредственно последовательность ПЦР продукта без первого клонированного фрагмента в югу от клонирования вектор таких, как TOPO плазмида. Obviously there are many advantages to the direct sequencing approach. Очевидно Есть много преимуществ прямого секвенирования подход. However, there are several disadvantages and steps which many people bypass only to have failed DNA sequencing results. Однако Есть ряд недостатков и мерах, которые многие люди обходят только не смогли результатов секвенирования ДНК.
Direct sequencing of PCR fragments is hardly successful unless you learn how to make it successful. Прямое секвенирование ПЦР фрагменты вряд ли успешной, если вы узнаете, как сделать его успешным. We have generated the following tips to make sure you don't fail in your direct sequencing attempts. Мы вызвали следующие советы, чтобы убедиться, что вы не в вашей прямой последовательности попыток.
1) Make sure that you have the right PCR product before you send your PCR product for sequencing. 1) Убедитесь, что вы имеете право ПЦР продукта, прежде чем отправить ПЦР продукта для секвенирования.
With sub-cloning PCR products into a vector, people usually restriction enzyme digest the bands out of the vector to check if it is the right sequence. Что к югу от клонирования продуктов ПЦР в вектор, люди, как правило, ограничение фермента дайджест полос из вектора проверить, если это право последовательности. Make sure you check the size of your PCR product carefully on the gel before you send it for sequencing. Убедитесь в том, что проверить размер ПЦР продукта внимательно на гель, прежде чем отправить ее для секвенирования. Also, if there are known restriction sites in the PCR fragment, make sure you use these to check that your product is the right one. Кроме того, если Существуют известные ограничения сайтов в ПЦР фрагментов, убедитесь, что вы пользуетесь этим, чтобы убедиться, что ваш продукт является правильным.
2) Make sure you don't have many non-specific products (bands on agarose gel)! 2) Убедитесь, что вы не много, не по конкретным продуктам (полосы на агарозном гель)!
PCR reactions rarely produce only a single (one) band. PCR реакции редко производят только один (одна) группа. Usually you will have many bands (non-specific products). Обычно у вас будет много полос (не конкретные продукты). Even if you can't see them, your PCR reaction may have many bands (non-specific products) that will cause your DNA sequencing to have many signals at each nucleotide (you get a jumbled sequence ie N (all 4 nucleotides) instead of 1 nucleotide). Даже если вы не можете увидеть их, ваша реакция ПЦР может иметь много полосах (не конкретных продуктов), что приведет вашу ДНК-последовательности иметь много сигналов на каждой нуклеотидов (вы получите последовательность jumbled т.е. N (все 4 нуклеотидов), а 1 нуклеотидов).
Using nested PCR primers can reduce this problem. Использование вложенных ПЦР праймеров может уменьшить эту проблему. It is also less likely that non-specific product will co-amplify through a second round of PCR with internally- Кроме того, что менее вероятно, не конкретный продукт будет совместно усилить с помощью второго раунда ПЦР с внутри -
nested primers. Вложенные грунтовки.
3) Remove all residual PCR primers and unincorporated nucleotides before sequencing. 3) удаление всех остаточных ПЦР грунтовки и неприсоединенной до последовательности нуклеотидов.
The good thing with sub-cloning is that you clone in the PCR fragment into the vector, amplify it, and purify it. Хорошая вещь к югу от клонирования состоит в том, что вы клон в ПЦР фрагмент в вектор, усилить ее, и очистить его. This way you have a very clean batch of DNA. Таким образом, у вас очень чистая партия ДНК. After PCR amplification however, you have a lot of unincorporated nucleotides, pcr primers, salts and proteins that can interfere with DNA sequencing. После ПЦР амплификации однако, у вас много неприсоединенной нуклеотидов, ПЦР грунтовки, солей и белков, которые могут вмешиваться в последовательности ДНК. Make sure you at least use a PCR clean-up step to ensure your DNA sequencing doesn't fail. Убедитесь, что вы, по крайней мере использовать ПЦР очистке шагом для обеспечения вашей ДНК-последовательности, не провал.
4) Ensure you don't send a very concentrated DNA sample! 4) обеспечить вас, не посылайте очень сконцентрированы образец ДНК!
Make sure that you double-check the template DNA concentrations before you send your PCR for sequencing. Убедитесь, что вы убедитесь шаблона ДНК концентрации, прежде чем отправить ПЦР для секвенирования. This is because PCR fragments are smaller than plasmids, and thus you get more DNA per sample. Это происходит потому, что ПЦР фрагментов меньше, чем плазмиды, и, таким образом, вы получите больше ДНК в образце. This makes PCR products more effective sequencing templates than the usual plasmids. Это делает ПЦР продукты более эффективной последовательности шаблонов, чем обычно плазмиды. Therefore you need to have lower concentrations for PCR products. Поэтому вам необходимо иметь более низкие концентрации для ПЦР продуктов.
For example, a 200 bp fragments needs to be just 2 ng/ul! Например, 200-BP фрагментов должна быть только 2 нг / UL! If your samples are at too high a concentration, not only will they NOT sequence any better but may cause your DNA sequencing to fail. Если образцы находятся на слишком высокой концентрации, не только они не последовательность каких-либо лучше, но может вызвать вашу последовательность ДНК на провал. Estimate your PCR product concentration by loading them with standards on an agarose gel. Оценка на ваш продукт ПЦР концентрация загружая их с нормами по агарозном гель. Usually laboratory spectrophotometers cannot with accurately measure the small amount of DNA that a PCR reaction generates (unless you use the newer micro-specs ie "Nanodrop"). Обычно лабораторные флуориметры не может с точной мерой небольшое количество ДНК, что порождает реакции ПЦР (если вы используете новые микро-спецификации т.е. "Nanodrop"). Based on your analysis, make sure you dilute them. Основываясь на своем анализе, не забудьте ослабить их.
Subcloning PCR Products and Sequencing them Subcloning ПЦР Продукты и чередование их
The most effective way to sequence PCR products is by subcloning them into vectors or plasmids. Наиболее эффективный способ определения последовательности ПЦР продуктов является subcloning их в векторы или плазмид. Usually this was done with primers that contained restriction enzyme sites. Обычно это делается с грунтовки, что ограничения, содержащиеся фермента сайтов. There were many problems with this including the fact that restriction enzymes have difficulties cutting at the ends of a PCR fragment. Были много проблем с этим в том числе ограничение факта, что ферменты имеют трудности резки на концах ПЦР фрагмента.
After cutting the PCR fragment, one would have to ligate the PCR fragment into a pre-cut vector that has compatible ends. После резки ПЦР фрагмент, придется перевязывать ПЦР фрагмент в предварительном сократить вектор, который совместим заканчивается. After amplification and purification of the plasmid, one would simply send the fragment for DNA sequencing. После усиления и очистки плазмиды, можно было бы просто отправить фрагмент для секвенирования ДНК. Most vectors have T7, T3, M13, and other primer sites which allows easy DNA sequencing using universal primers (such as the commonly available T7 primer, T3 primer, and M13 primers). Большинство векторов имеют T7, T3, M13, а также другие участки грунта, которая позволяет легко секвенирования ДНК с помощью универсального грунтовки (как, например, широко доступны T7 грунтовки, T3 грунтовки, грунтовки и M13).
TOPO Vectors for PCR sub-cloning TOPO Вектора для ПЦР к югу от клонирования
The latest greatest innovations allowed many to bypass the difficulties or subcloning PCR products into regular vectors. Последняя большая нововведения позволили обойти многие трудности или subcloning PCR продуктов в обычные векторов. TOPO cloning allowed the RAPID and easy cloning of PCR products into vectors. TOPO клонирование разрешено быстрого и легкого клонирования ПЦР продуктов в векторах. TOPO cloning is very quick (5 minutes for ligation) and very effective. TOPO клонирование очень быстро (5 минут для ligation) и очень эффективным. You can easily clone your PCR fragment into the vector without any restriction sites. Вы можете легко клонировать ваш ПЦР фрагмент в вектор без каких-либо ограничений сайтов. This is due to the fact that many DNA polymerases add an extra A to the ends of the DNA fragment. Это объясняется тем фактом, что многие ДНК polymerases добавить дополнительно к концам фрагмента ДНК. This allowed the cloning of the PCR fragments into TOPO vectors (or TA vectors) which contained free T ends. Это позволило клонирование ПЦР фрагментов в TOPO векторов (или векторы ТА), в котором содержится свободный Т заканчивается. TOPO vectors contain Topoisomerase enzyme which enhances the cloning of PCR fragments into the vector. TOPO векторов топоизомеразы содержат фермент, который способствует клонирование фрагментов ПЦР в вектор.
TOPO vectors are available at Invitrogen TOPO векторов можно ознакомиться на Invitrogen
Copyright 2006 PCR Station Copyright 2006 PCR станции