Troubleshooting PCR
Проблемы PCR и разрешения, помощь PCR
Что ваша проблема PCR?:
Длинние неспецифичные продукты PCR?
Проблема:
Длинние неспецифичные продукты в PCR
Гель агарозы вы пятнаете более большие неспецифичные диапазоны PCR которые правые определяют размер.
Разрешения к длинним неспецифичным продуктам в PCR:
Уменьшите продолжительность отжига
Уменьшите время выдвижения
Уменьшите температуру выдвижения к 62-68º c
Увеличьте концентрацию KCl (буфера) к 1.2x-2x, но сдержите концентрацию MgCl2 на 1.5-2mM
Увеличьте концентрацию MgCl2 до 3-4.5 mM но сдержите константу концентрации dNTP.
Используйте меньше праймер
Примите меньше шаблон дна
Примите меньше полимеразу Taq
Если никакие из вышеуказанных работ:, то проверите праймер для повторяющийся последовательностей (ВЗРЫВ выравнивает последовательность с базами данных) и измените праймеры
Сочетание из некоторые/вс выше.
Проблема:
Димеры праймера PCR
Гель агарозы, вы пятнаете некоторые очень малые диапазоны PCR. Эти размер вашего праймера или о размере обоих ваших праймеров (a и b) совместно. Эти термин «димерами праймера» и сформированы отжигом вашего праймера с собой или с другим праймером.
Разрешения к димерам праймера в PCR:
Используйте меньше праймер.
Праймер переконструкции и приказывает новую серию. Убеждайтесь вы ПО и проверка конструкции праймера пользы для собственн-отжига и что праймеры не делят большой процент комплементарной последовательности. Проверите праймеры тщательно для гомо-димера и образования hetero-димера с OligoAnalyzer
Дирижируйте PCR с и без формамида.
Титруйте концентрацию Mg2+ (MgCl - 1.5, 2.0, 2.5 и 3.0 mM).
Увеличьте количество шаблона дна (концентрацию).
Увеличьте температуру нагрева при отжиге (попытку оптимизируя используя машину PCR градиента для того чтобы найти оптимальная температура для отжига).
Попробуйте добавить DMSO до 5%.
Попробуйте использовать PCR HotStart вместо регулярн PCR полимеразы Taq.
Сочетание из некоторые/вс выше.