RT-PCR
Обратите цепную реакцию полимеразы транскрипции
Обратная цепная реакция полимеразы транскрипции (RT-PCR) основана на цепной реакции полимеразы (PCR). Более важно она основана на процессе обратной транскрипции, которому обратный транскрибирует RNA в дна и первоначально было изолировано от retroviruses.
Методы RT-PCR позволяют образованию cDNA (комплементарного или дна экземпляра) от RNA, который хранит последовательность RNA (как RNA посыльного, mRNA) в более стабилизированной форме нуклеиновой кислоты, дна. Эта обратная транскрипция от RNA в свое обратное дна комплекта (cDNA) первый шаг обычно two-step процесса RT-PCR. Furthermore, путем копировать RNA в дна, одно может после этого усилить последовательность cDNA путем использование праймеров специфических для последовательности дна. Эта амплификация окончательный второй крупный шаг two-step процесса RT-PCR.
Процесс RT-PCR
Первый шаг RT-PCR назван «первая реакция стренги». В реакции перв-стренги, комплементарное cDNA дна также термин, сделано от шаблона RNA посыльного интереса используя oligo dT (поступок подобный к праймерам и связи до 3 ' последовательность расположенная на 3 ' UTR - untranslated зона polyA, которые присутствовал в большинств mRNAs), dNTPs олигонуклеотида поли-dTs, и RNA-зависимая полимераза дна, обращает transcriptase, через процесс обратной транскрипции.
Эти факторы совмещены в обратном буфере transcriptase на 1 час на 37°C. После того как обратная реакция transcriptase закончена, и cDNA было синтезировано, RNaseH добавлено (энзим пищеварения RNA) которое усваивает RNA далеко от гибрида rNA-cDNA. После инкубации с RNaseH, стандартные PCR или цепная реакция полимеразы дирижированы используя праймеры дна oligo специфические для последовательности интереса. Этот второй шаг назван «вторая реакция стренги».
Таким образом путем добавлять термостабильную полимеразу дна, праймеры в верхней части потока и идущие дальше по потоку дна, одиночное, котор сели на мель дна будут сели на мель двойником, котор и усилены, позволяющ обнаружению даже редких или низких последовательностей mRNA экземпляра путем усиливать свое комплементарное дна.
Применения RT-PCR
Степенная амплификация комплементарной последовательности mRNA или последовательностей RNA через обратную цепную реакцию полимеразы транскрипции прибавлять на высокий метод обнаружения чувствительности, где низкий номер экземпляра или более менее обильные молекулы RNA можно обнаружить. Она также использована для того чтобы клонировать последовательности mRNA в форме комплементарного дна, позволяющ архивам cDNA (архивов cDNA) быть созданным которые содержат все последовательности mRNA генов выраженных в клетке. Furthermore, она позволяет творению стек cDNA которые были клонированы RT-PCR и позволяют выражению генов на уровнях RNA и протеина для более дальнеишего изучения.