PCR Limitations and Disadvantages ПЦР ограничења и недостаци
The High Sensitivity of PCR Висока осетљивост ПЦР
Due to the extremely high sensitivity of PCR, contamination from non-template PCR present in the lab environment (from bacteria, viruses, and your own DNA) presents a real problem. Због изузетно високе осетљивост ПЦР, загадјења од не-шаблона садашњости ПЦР у учионици околину (од бактерија, вируса, и властите ДНК) представља стварни проблем. Precautions therefore must be taken. Мере опреза, дакле, мора бити схваћене. Several steps can be taken to prevent and minimize PCR contamination including the use of aerosol barrier tip filters, laminar flow cabinet, and a special preparation area for PCR separate from the DNA isolation area. Неколико корака може се спречити и минимизирање ПЦР контам укључујући коришћење аеросол препреку Савет филтере, ламинарни кабинет, и посебан простор за припрему ПЦР одвојено од ДНК изолацију подручја.
Polymerase Errors Полымерасе Грешке
DNA polymerase are not perfect by any means, however they are quite good at what they do. ДНК полымерасе нису савршени на било који начин, ипак су прилично добро на што чине. Mistakes and errors do happen in PCR by DNA polymerases in the test tube and in the human body. Грешака и грешака чинити се десити у ДНК ПЦР по полымерасес у епрувета и у људском телу. The polymerases used in PCR often lack 3' to 5' exonuclease activity such as Taq polymerase. У полымерасес ПЦР често користи у недостатку 3 'за 5' ексонуцлеасе активности као што су Так полымерасе. This enzyme lacks the ability to correct misincorporated nucleotides, an activity which is present in higher eukaryotes. Овај ензим недостаје способност да исправи мисинцорпоратед нуклеотидима, активност која је присутан у виших еукариота.
A polymerase lacking the 3' to 5' exonuclease activity has a higher error rate, around 1 in 10000 bases are misincorporated. А полымерасе нема 3'5 'ексонуцлеасе активност има вишу учесталост грешака, око 1 у 10000 базе су мисинцорпоратед.
Recombinant polymerases have been generated and other polymerases have been isolated which are available to more accurate PCR and have a variety of applications such as sequencing. Рекомбинантним полымерасес су генерисани и других полымерасес су изоловани који су доступни на више тачних ПЦР и имају различите примене као што су довођење.
Examples of polymerases with 3' to 5' exonuclease activity include: Vent, which is extracted from Thermococcus litoralis , Pfu which is extracted from Pyrococcus furiosus, and Pwo which is extracted from Pyrococcus woesii . Примери полымерасес са 3 'за 5' ексонуцлеасе активности укључују: Венте, који је с Тхермоцоццус литоралис, Пфу који је издвојити из Пыроцоццус фуриосус и Пуо који је издвојити из Пыроцоццус уоесии.
PCR Polymerase Enzyme Proficiency and PCR Product Size / Length Limitations ПЦР Полымерасе ензим знање и ПЦР производ Величина / дужина ограничења
DNA polymerase are proficient enough to efficiently amplify DNA products up to a few thousand basepairs (2-5 kb). ДНК полымерасе су довољно искусан да ефикасно повећати ДНК производи и до неколико хиљада басепаирс (2-5 кб). PCRs of longer products are less efficient due to enzyme activity loss, and inaccuracies introduced by longer PCRs. ПЦРс од више производе мање ефикасан ензим активност због губитка, и неточности које је увео више ПЦРс. Adding fresh DNA polymerase helps with enzyme activity lost due to the half life of the polymerase, however this does not help when accurate PCR is required. Додавање свеже ДНК полымерасе помогне у ензим активност изгубио због пола живота у полымерасе, но то не помогне приликом тачне ПЦР је потребно.
It is possible to amplify PCR products up to 20kb using lower or slower heating cycles and special mixtures of polymerases. Могуће је проширити ПЦР производе до 20кб користећи доњи или спорије циклусима грејања и посебна мешавина од полымерасес. Long and Accurate PCR is accomplished by using mixtures of processive polymerases and high fidelity Polymerases. Дуге и точног ПЦР је остварен уз помоћ мјешавине од процессиве полымерасес и висока Квалитет Полымерасес.