PCR Product Sequencing ПЦР производ по реду
How To Sequence Your PCR Products Како слијед ваше ПЦР производа
Once you amplify your DNA sequence of interest, you usually need to check the amplification quality and accuracy using DNA sequencing services. Када повећати ваше ДНК слијед интереса, обично је потребно да проверите појачање квалитета и точности помоћу секвенцирање ДНК услуге. There are several methods to do this and each method has its advantages and disadvantages. Постоји неколико начина за то и свака метода има своје предности и недостатке.
Direct Sequencing of PCR Products Директни редослијед од ПЦР производа
Direct sequencing of PCR products is obviously the quickest method although it is not always the most successful method. Директни редослијед од ПЦР производа очигледно је најбржи начин иако то није увек најуспешнији начин. It is possible to directly sequence a PCR product without having first cloned the fragment into a sub-cloning vector such as a TOPO plasmid. Могуће је директно слијед један ПЦР производ без цлонед је први део у под-Клонирање Вектор као што је ТОПО пласмид. Obviously there are many advantages to the direct sequencing approach. Очито постоје многе предности у реду директан приступ. However, there are several disadvantages and steps which many people bypass only to have failed DNA sequencing results. Међутим, постоји неколико недостатака и кораке које многи људи заобићи само да нису секвенцирање ДНК резултате.
Direct sequencing of PCR fragments is hardly successful unless you learn how to make it successful. Директни редослијед од ПЦР фрагмената једва успешан осим ако научите како да то успешно. We have generated the following tips to make sure you don't fail in your direct sequencing attempts. Ми смо генерише следеће савете како би били сигурни да не успети у свом директном низањем покушаја.
1) Make sure that you have the right PCR product before you send your PCR product for sequencing. 1) Осигурајте да имате право ПЦР производ пре него што пошаљете ваше ПЦР производ за низањем.
With sub-cloning PCR products into a vector, people usually restriction enzyme digest the bands out of the vector to check if it is the right sequence. Уз под-Клонирање ПЦР производе у Вектор, људи обично ограничење ензим сажето је бендова из на Вектор проверавати да ли је право слијед. Make sure you check the size of your PCR product carefully on the gel before you send it for sequencing. Проверите величину ваше ПЦР производ пажљиво на гел пре него што га пошаљете за низањем. Also, if there are known restriction sites in the PCR fragment, make sure you use these to check that your product is the right one. Такође, ако су познати ограничење интерфејса у ПЦР фрагмент, проверите да ли користили те да проверите свој производ прави је један.
2) Make sure you don't have many non-specific products (bands on agarose gel)! 2) Постарајте се да немате много не-специфичне производе (бендова на агаросе гел)!
PCR reactions rarely produce only a single (one) band. ПЦР реакције ретко производити само један (један) појас. Usually you will have many bands (non-specific products). Обично ћете имати много бендова (не-специфини производи). Even if you can't see them, your PCR reaction may have many bands (non-specific products) that will cause your DNA sequencing to have many signals at each nucleotide (you get a jumbled sequence ie N (all 4 nucleotides) instead of 1 nucleotide). Чак и ако не можете их видети, ваше ПЦР реакција мај имати много бендова (не-специфини производи) које ће изазвати ваше секвенцирање ДНК да су многи сигнали у сваком нуклеотидни (добијате збрканим слијед тј Н (све 4 нуклеотидима) уместо 1 нуклеотидни).
Using nested PCR primers can reduce this problem. Коришћење Нестед ПЦР почетници може смањити овај проблем. It is also less likely that non-specific product will co-amplify through a second round of PCR with internally- Такође је мање вероватно да не-специфичан производ ће цо-појачавати кроз други круг ПЦР с интерно --
nested primers. уметнута почетници.
3) Remove all residual PCR primers and unincorporated nucleotides before sequencing. 3) Уклоните све преостали ПЦР почетници и унинцорпоратед нуклеотидима пре реду.
The good thing with sub-cloning is that you clone in the PCR fragment into the vector, amplify it, and purify it. Добра ствар с под-клонирања је да клон у ПЦР фрагмент у Вектор, проширити га и очистити га. This way you have a very clean batch of DNA. Тако имате шаржни врло чисте ДНК. After PCR amplification however, you have a lot of unincorporated nucleotides, pcr primers, salts and proteins that can interfere with DNA sequencing. Након ПЦР амплификација међутим, имате пуно унинцорпоратед нуклеотидима, ПЦР почетници, соли и протеини које могу ометати секвенцирање ДНК. Make sure you at least use a PCR clean-up step to ensure your DNA sequencing doesn't fail. Проверите да ли сте барем користити исту ПЦР-уп корак како бисте обезбедили своје секвенцирање ДНК не успети.
4) Ensure you don't send a very concentrated DNA sample! 4) обезбеђује да не шаљете врло сконцентрисан ДНК узорак!
Make sure that you double-check the template DNA concentrations before you send your PCR for sequencing. Постарајте се да вам двострука провјера шаблон ДНК концентрације пре него што пошаљете ваше ПЦР за низањем. This is because PCR fragments are smaller than plasmids, and thus you get more DNA per sample. То је зато што ПЦР фрагмената су мањи од плазмиди, а тиме добијате више ДНК по узорку. This makes PCR products more effective sequencing templates than the usual plasmids. То чини ПЦР производе ефикаснији низањем шаблоне од уобичајених плазмиди. Therefore you need to have lower concentrations for PCR products. Зато морате имати нижи за концентрације ПЦР производа.
For example, a 200 bp fragments needs to be just 2 ng/ul! На пример, БП 200 уломака треба само 2 НГ / ул! If your samples are at too high a concentration, not only will they NOT sequence any better but may cause your DNA sequencing to fail. Ако је Ваш узорцима су на превисок фокусом, не само да ће се то није боље него било који слијед мај узрок ваше секвенцирање ДНК на пропаст. Estimate your PCR product concentration by loading them with standards on an agarose gel. Процените ваше ПЦР производ концентрација од итава их са стандардима на агаросе гел. Usually laboratory spectrophotometers cannot with accurately measure the small amount of DNA that a PCR reaction generates (unless you use the newer micro-specs ie "Nanodrop"). Обино не спецтропхотометерс мозе лабораторијске с тачно мерење малих количина ДНК да се ПЦР реакција ствара (осим ако користите новију микро-наочаре тј "Нанодроп"). Based on your analysis, make sure you dilute them. На основу Вашег анализу, проверите да ли их разблажити.
Subcloning PCR Products and Sequencing them Субцлонинг ПЦР Производи и низањем их
The most effective way to sequence PCR products is by subcloning them into vectors or plasmids. Најефикаснија начин да се слијед ПЦР производа је субцлонинг их у вектора или плазмиди. Usually this was done with primers that contained restriction enzyme sites. Обично се то догодило с почетници које су садржане ограничење ензим интерфејса. There were many problems with this including the fact that restriction enzymes have difficulties cutting at the ends of a PCR fragment. Било је много проблема са овим укључујући и чињеницу да је ограничење ензими имају тешкоће разрезивање на крајевима, а ПЦР фрагмент.
After cutting the PCR fragment, one would have to ligate the PCR fragment into a pre-cut vector that has compatible ends. Након резања је ПЦР фрагмент, један би морао да лигате на ПЦР фрагмент у унапред одређен Вектор који је компатибилан завршава. After amplification and purification of the plasmid, one would simply send the fragment for DNA sequencing. Након појачање и пречишћавање од пласмид, један би једноставно послати уломак за секвенцирање ДНК. Most vectors have T7, T3, M13, and other primer sites which allows easy DNA sequencing using universal primers (such as the commonly available T7 primer, T3 primer, and M13 primers). Већина вектора имају Т7, Т3, М13, и упаљач друге уеб-мјеста која омогућава лако секвенцирање ДНК користећи универзални почетници (као што је уобичајено доступан Т7 упаљач, упаљач Т3, почетници и М13).
TOPO Vectors for PCR sub-cloning ТОПО вектора за Клонирање ПЦР под --
The latest greatest innovations allowed many to bypass the difficulties or subcloning PCR products into regular vectors. Најновији највећи дозвољени многе иновације за заобићи потешкоће или субцлонинг ПЦР производа у редовној вектора. TOPO cloning allowed the RAPID and easy cloning of PCR products into vectors. ТОПО Клонирање дозвољено је брзо и лако за Клонирање ПЦР производе у вектора. TOPO cloning is very quick (5 minutes for ligation) and very effective. ТОПО клонирања је врло брзо (5 минута за лигатион) и врло ефикасне. You can easily clone your PCR fragment into the vector without any restriction sites. Једноставно клон Ваш ПЦР фрагмент у Вектор интерфејса без икаквих ограничења. This is due to the fact that many DNA polymerases add an extra A to the ends of the DNA fragment. То је због чињенице да су многи ДНК полымерасес додати додатни А до краја ДНК фрагмент. This allowed the cloning of the PCR fragments into TOPO vectors (or TA vectors) which contained free T ends. То је Клонирање дозвољено је у ТОПО ПЦР фрагмената вектора (или ТА вектора), које су садржане бесплатно Т завршава. TOPO vectors contain Topoisomerase enzyme which enhances the cloning of PCR fragments into the vector. ТОПО топоизомераза вектора садрже ензим који потиче од Клонирање ПЦР фрагмената у Вектор.
TOPO vectors are available at Invitrogen ТОПО вектора су доступни на Инвитроген
Copyright 2006 PCR Station Цопыригхт 2006 ПЦР станица