RT-PCR Рт-ПЦР
Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Реверзна транскрипција Полымерасе Ланчана реакција
Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) is based on the polymerase chain reaction (PCR). Реверзна транскрипција полымерасе Ланчана реакција (Рт-ПЦР) темељи се на полымерасе Ланчана реакција (ПЦР). More importantly it is based on the process of reverse transcription, which reverse transcribes RNA into DNA and was initially isolated from retroviruses. Још важније је на основу обрнути процес транскрипције, који обрнутог трансцрибес ДНК и РНА у почетку је био изолиране од ретровирусес.
The techniques of RT-PCR allows the formation of cDNA (complementary or copy DNA) from RNA, which stores the sequence of RNA (such as messenger RNA, mRNA) in the more stable form of nucleic acid, DNA. У техникама Рт-ПЦР омогућава формирање цДНА (комплементарна ДНК или копија) од РНА, који складишти слијед РНА (као што је гласник РНА, мРНА) у облику стабилан више од нуклеинске киселине, ДНК. This reverse transcription from RNA into its reverse complement DNA (cDNA) is the first step of a usually two-step process of RT-PCR. То РНА из транскрипције реверси у своје наличје допуна ДНК (цДНА) је први корак, а обично два-корак процес Рт-ПЦР. Furthermore, by copying the RNA into DNA, one can then amplify the cDNA sequence by using primers specific for the DNA sequence. Понатаму, копирањем и РНА у ДНК, тада се може проширити на цДНА слијед користећи почетници специфичне за ДНК секвенци. This amplification is the final second major step of the two-step process of RT-PCR. Ово појачање је коначни други велики корак у два корака од Рт-ПЦР.
The Process of RT-PCR Процес Рт-ПЦР
The First step of RT-PCR is referred to as the "first strand reaction". Први корак у Рт-ПЦР је наведено као "први жал реакција". In the first-strand reaction, complementary DNA also termed cDNA, is made from the messenger RNA template of interest using oligo dT (oligonucleotide poly-dTs act similar to primers and bind to the 3' polyA sequence located at the 3' UTR - untranslated region, which are present in most mRNAs), dNTPs, and an RNA-dependent DNA polymerase, reverse transcriptase, through the process of reverse transcription. У прве реакције на цједилу, комплементарни ДНК и цДНА назвао, израђен је од гласник РНА шаблон интереса коришћењем олиго ДТ (олигонуцлеотиде политика ДТС деловати слично почетници и свезати на 3 'Полы слијед налази на 3' УТР - унтранслатед регије, које су присутне у већини мРНАс), дНТПс и РНА-овисна ДНК полымерасе, обрнутог трансцриптасе, кроз обрнути процес транскрипције.
These factors are combined in a reverse transcriptase buffer for 1 hour at 37°C. Ови су фактори у комбинацији у обрнутог трансцриптасе оставу за 1 сат на 37 ° Ц. After reverse transcriptase reaction is complete, and the cDNA has been synthesized, RNaseH is added (an RNA digestion enzyme) which digests the RNA away from the RNA-cDNA hybrid. Након обрнутог трансцриптасе реакција је завршена, а цДНА је умјетни, РНасеХ је додао (представник РНА пробава ензим) који дигестс је удаљена од РНА РНА-цДНА Хибридна. After incubation with RNaseH, standard PCR or polymerase chain reaction is conducted using DNA oligo primers specific for the sequence of interest. Након инкубације с РНасеХ, стандардни ПЦР или полымерасе Ланчана реакција се спроводи помоћу ДНК олиго почетници специфичне за слијед од камата. This second step is referred to as the "second strand reaction". Овај други корак је наведено као "други жал реакција".
Thus by adding the thermostable DNA polymerase, upstream and downstream DNA primers, the single stranded DNA becomes double stranded and is amplified, allowing the detection of even rare or low copy mRNA sequences by amplifying its complementary DNA. Тако додавањем термостабилан ДНК полымерасе, узводно и низводно ДНК почетници, у једном ДНК постаје двоструки насукан и појачавају, чиме је откривање чак и ретки или ниским копија мРНА секвенце које појаццавањем његов комплементарни ДНК.
Applications of RT-PCR Програми и Рт-ПЦР
The exponential amplification of complementary sequence of mRNA or RNA sequences via reverse transcription polymerase chain reaction allow for a high sensitivity detection technique, where low copy number or less abundant RNA molecules can be detected. У експоненцијална појачање од комплементарни мРНА слијед или РНА секвенце путем обрнутог транскрипција полымерасе Ланчана реакција омогућава високу осетљивост за откривање техника, где низак број копија или мање обилне РНА молекула може бити откривен. It is also used to clone mRNA sequences in the form of complementary DNA, allowing libraries of cDNA (cDNA libraries) to be created which contain all the mRNA sequences of genes expressed in a cell. Такође се користи за клон мРНА секвенце у облику комплементарна ДНК, чиме библиотеке од цДНА (цДНА библиотеке) да се уредник који садрже све мРНА секвенце гена изражени у поље. Furthermore, it allows the creation of cDNA constructs which were cloned by RT-PCR and allow the expression of genes at the RNA and protein levels for further study. Понатаму, то омогућава стварање цДНА конструктора који су цлонед бы Рт-ПЦР и допустити изражавање гена на нивоу РНА и беланчевина за даља истраживања.