Discovery of PCR Upptäckten av PCR
Inventor of PCR Uppfinnare av PCR
PCR , or Polymerase Chain Reaction was first popularly thought to have been conceived by Dr. Kerry Mullis in 1983 while working at the Cetus Corporation in Emeryville, CA, along with other researchers at Cetus Corporation. Cetus Corporation discovered a method to start and stop DNA polymerase enzyme activity at specific points along a single strand of DNA. On the other hand, some pioneering research was also done by Gobind Khorana, who described a basic principle of replicating a piece of DNA using two primers (1971). Kerry Mullis discovered that by harnessing this component of molecular reproduction technology, a target DNA of interest could be amplified exponentially. This DNA amplification procedure was an in vitro process (meaning in a test-tube). PCR, eller polymerase chain reaction först populärt tros ha befruktats av Dr Kerry Mullis 1983 medan du arbetar på Cetus Corporation i Emeryville, Kalifornien, tillsammans med andra forskare vid Cetus Corporation. Cetus Corporation upptäckte en metod att starta och stoppa DNA polymeras enzymaktivitet på specifika punkter längs en del av DNA. Å andra sidan, några banbrytande forskning har också utförts av Gobind Khorana, som beskrev en grundläggande princip att reproducera en bit DNA som använder två första (1971). Kerry Mullis upptäckt att genom att utnyttja denna del av molekylära reproduktion teknik, en mål-DNA av intresse amplifieras exponentiellt. Denna DNA-amplifiering förfarande var ett in vitro-processen (dvs. i ett provrör).
Cell-free DNA amplification by PCR was able to simplify many of the standard procedures for DNA cloning, DNA analysis, and the modification of DNA. Previous molecular biology techniques for isolating a specific piece of DNA had relied on gene cloning, which is a tedious and slow procedure. PCR, as Kerry Mullis stated “lets you pick the piece of DNA you’re interested in and have as much of it as you want”. Cell-free DNA-amplifiering av PCR kunde förenkla många av de standardiserade förfaranden för DNA kloning, DNA-analys och modifiering av DNA. Föregående molekylärbiologisk teknik för att isolera en specifik del av DNA hade förlitat sig på genen kloning, som är en mödosam och långsamt förfarande. PCR, som Kerry Mullis anges "kan du ta del av DNA du är intresserad av och har så mycket av det som du vill".
Progress for the development was initially limited by primer synthesis and polymerase purification issues. When Cetus scientists eventually succeeded in making the polymerase chain reaction perform as desired in a reliable fashion, they had an immensely powerful technique for providing almost unlimited quantities of the precise genetic material molecular biologists and others required for their research. Since the first report in1985, more than 5000 scientific papers were published by 1992. Framsteg för utvecklingen var inledningsvis begränsas av primer syntes och polymeras rening frågor. När Cetus forskare slutligen lyckats göra polymerase chain reaction fungera som önskat på ett tillförlitligt sätt, de hade en oerhört kraftfull teknik för att få en nästan obegränsade mängder av exakta genetiska material molekylär biologer och andra som krävs för deras forskning. Sedan den första rapporten in1985, mer än 5000 vetenskapliga artiklar har publicerats från 1992.
Kerry Mullis's PCR Idea Kerry Mullis's PCR idé
In Mullis’s head, the discovery grew from a theoretical scheme to perform limited dideoxynucleotide sequencing of unique human genes using synthetic oligonucleotides for the purpose of diagnosing common human disease mutations. An obvious obstacle to such a direct sequencing strategy was the high complexity of the human genome (3.3 X 10^9 base pairs). Therefore, a second oligonucleotide or primer was added to block the progression of the synthesis of the first primer. Later in his thinking however, the second primer was included to bind to the other DNA strand, so that each strand of the mutant allele would contribute to the eventual signal. If the scheme involving simultaneous hybridization of primers to each strand was changed by heating the mixture and then repeating the annealing and extension steps, then the primary signal would be increased even more. Repetition of the steps would allow the products of the first cycle to be duplicated in the second cycle, to yield two copies. Repeating the steps in the cycle again would result in four copies, et cetera . I Mullis huvud, upptäckten växte från ett teoretiskt system för att utföra begränsade dideoxynucleotide sekvensering av unika mänskliga gener med hjälp av syntetiska oligonucleotides för diagnostik av vanliga sjukdomar hos människan mutationer. Ett uppenbart hinder för en sådan direkt sekvensering strategi var den höga komplexiteten i mänskliga arvsmassan (3,3 X 10 ^ 9 baspar). därför en andra oligonucleotide eller primer har lagts till för att blockera utvecklingen av syntesen av de första primer. Senare i sitt tänkande men den andra primer ingick att binda till andra DNA Strand, så att varje del av mutant allel skulle bidra till en eventuell signal. Om systemet innebär samtidigt hybridisering av första att varje del har ändrats genom att hetta upp blandningen och sedan upprepa glödgning och förlängning steg, då det primära signal skulle öka ännu mer. Upprepning av åtgärder skulle göra det möjligt för produkter av den första serien att tas upp även i den andra omgången, för att ge två exemplar. upprepa stegen i cykeln igen skulle resultera i fyra exemplar, et cetera.
Several weeks passed before this great idea was even attempted at the company labs. Eventually, two oligonucleotide primers were synthesized to be perfectly complementary to each end of the 110 base pair region of a cloned segment of the human beta-globin gene, the amplification was performed, and the DNA products were identified by acrylamide gel electrophoresis. The end result was the anticipated 110 base pair DNA fragment, and the beginning of PCR as a basic technique in molecular biology. Flera veckor innan denna stora idé var även försökt på bolaget Labs. Till slut, två oligonukleotidprimers var syntetiserade att vara perfekt komplement till vardera ändan av 110 bas par regionen av ett klonat del av den mänskliga beta-globingenen, förstärkningen var utföras, och det DNA som togs fram av akrylamid gelelektrofores. Slutresultatet var den förväntade 110 bas par DNA-fragment, och i början av PCR som en grundläggande teknik i molekylärbiologi.
Initial Problems With PCR Initiala problem med PCR
In Mullis's original PCR process, the enzyme was used in vitro . I Mullis ursprungliga PCR-processen, ett enzym som användes för in vitro. The double-stranded DNA was separated into two single strands of DNA by heating it to 96°C. Den dubbelsträngat DNA var separerade i två enda DNA-fragment genom att värma det till 96 ° C. At this temperature, however, the E.Coli DNA polymerase was destroyed, so that the enzyme had to be replenished with new fresh enzyme after the heating stage of each cycle. Vid denna temperatur, men de E. coli DNA-polymeras förstördes, så att enzymet måste fyllas på med nya färska enzym efter värmen fas av varje cykel. Mullis's original PCR process was very inefficient since it required a great deal of time, vast amounts of DNA-Polymerase, and continual attention throughout the PCR process. Mullis ursprungliga PCR-processen var mycket ineffektivt, eftersom det krävs mycket tid, stora mängder av DNA-polymeras, och ständig uppmärksamhet under PCR-processen. Other researchers and companies had to greatly improve the technology and enzymes with the result that PCR now is home to hundreds if not thousands of companies and research institutes which work on improving PCR quality, fidelity, and the processivity of PCR (the length of DNA that can be amplified). Andra forskare och företag varit tvungna att kraftigt förbättra teknik och enzymer vilket leder till att PCR nu är hem för hundratals om inte tusentals företag och forskningsinstitut som arbetar på att förbättra PCR-kvalitet, trohet, och processivity av PCR (längden på DNA som kan kompletteras).
See PCR Development and History Se PCR utveckling och historia