Polymerase Chain Reaction - PCR Basics Polymerase chain reaction - PCR Basics
Polymerase Chain Reaction: An Alternative to cloning Polymerase chain reaction: ett alternativ till kloning
An alternative to cloning called the polymerase chain reaction PCR can be used to directly amplify rare specific DNA sequences in a complex mixture when the ends of the sequence are known. This method of amplifying rare sequences from a mixture has numerous applications in basic research, human genetics testing and forensics. Ett alternativ till kloning kallas polymerase chain reaction PCR kan användas för att direkt förstärka sällsynta specifika DNA-sekvenser i en komplex blandning när ändarna på sekvensen är kända. Denna metod för att förstärka sällsynta sekvenser från en blandning har många tillämpningar inom grundläggande forskning, mänskliga genetisk testning och kriminalteknisk.
Genomic DNA is digested into large fragments using a restriction enzyme and then is heat-denatured into single strands. Two synthetic oligonucleotides complementary to the 3’ ends of the target DNA segment of interest are added in great excess to the denatured DNA, and the temperature is lowered to 50-60° C. Arvsmassans DNA genom rötning i stora fragment med hjälp av en begränsning enzym och sedan är värme-denaturerad i separata delar. Två syntetiska oligonucleotides komplement till 3 'ändarna av mål-DNA segment av intresse läggs i stora överskott till denatureras DNA, och temperaturen skall sänkas till 50-60 ° C.
The genomic DNA remains denatured, because the complementary strands are at too low a concentration to encounter each other during the period of incubation, but the specific oligonucleotides, which are at a very high concentration, hybridize with their complementary sequences in the genomic DNA. Arvsmassans DNA är denaturerad, eftersom de kompletterar varandra är en för låg koncentration för att stöta på varandra under den period av inkubationstiden, men de särskilda oligonucleotides, som är i en mycket hög koncentration, hybridiseras med deras kompletterande sekvenser i arvsmassans DNA.
The hybridized oligonucleotides then serve as primers for DNA chain synthesis, which begins upon addition of a supply of deoxynucleotides and a temperature resistant DNA polymerase such as that from Thermus aquaticus (a bacterium that lives in hot springs). Den hybridiseras oligonucleotides sedan fungera som grundfärg för DNA-kedjan syntes, som börjar vid tillsättning av en leverans av deoxynucleotides och en temperatur resistenta DNA-polymeras som att från Thermus aquaticus (en bakterie som lever i varma källor).
This enzyme, Taq polymerase can extend the primers at temperatures up to 72° C. Detta enzym, Taq-polymeras kan utvidga den grundfärg vid temperaturer upp till 72 ° C.
When synthesis is complete, the whole mixture is heated up further (to 95°) to melt the newly formed DNA duplexes. När syntesen är klar, hela blandningen värms upp ytterligare (till 95 °) för att smälta det nybildade DNA duplexes.
When the temperature is lowered again, another round of synthesis takes place because excess primer is still present. När temperaturen sänks igen, ytterligare en runda av syntesen äger rum på grund av överkapacitet primer är fortfarande aktuella.
Repeated cycles of synthesis (cooling) and melting (heating) quickly amplify the sequence of interest. Upprepade cykler av syntesen (kylning) och smältning (uppvärmning) snabbt förstärker den sekvens av intresse.
At each round, the number of copies of the sequences between the primer sites is doubled; therefore, the desired sequence increases exponentially. Vid varje runda, det antal exemplar av sekvenser mellan primer webbplatser fördubblas, och att det därför den önskade sekvensen ökar exponentiellt.