PCR Limitations and Disadvantages PCR begränsningar och nackdelar
The High Sensitivity of PCR Mycket känsliga PCR
Due to the extremely high sensitivity of PCR, contamination from non-template PCR present in the lab environment (from bacteria, viruses, and your own DNA) presents a real problem. På grund av extremt hög känslighet PCR, kontaminering från icke-mall PCR i lab miljö (från bakterier, virus, och din egen DNA) utgör ett verkligt problem. Precautions therefore must be taken. Försiktighetsåtgärder därför måste vidtas. Several steps can be taken to prevent and minimize PCR contamination including the use of aerosol barrier tip filters, laminar flow cabinet, and a special preparation area for PCR separate from the DNA isolation area. Flera åtgärder kan vidtas för att förebygga och minimera PCR-smitta bland annat med hjälp av aerosol hinder spets filter, laminärt flöde skåp, och en särskild beredning område för PCR separat från DNA isolerat område.
Polymerase Errors Fel polymerashämmare
DNA polymerase are not perfect by any means, however they are quite good at what they do. DNA-polymeras är inte perfekt på något sätt, men de är ganska bra på vad de gör. Mistakes and errors do happen in PCR by DNA polymerases in the test tube and in the human body. Misstag och fel händer i PCR med DNA-polymeras i provrör och i människokroppen. The polymerases used in PCR often lack 3' to 5' exonuclease activity such as Taq polymerase. Den polymeraser som används i PCR ofta saknar 3 "till 5" exonuclease verksamhet såsom Taq-polymeras. This enzyme lacks the ability to correct misincorporated nucleotides, an activity which is present in higher eukaryotes. Detta enzym saknar förmåga att korrekt misincorporated nukleotider, en aktivitet som förekommer i högre eukaryoter.
A polymerase lacking the 3' to 5' exonuclease activity has a higher error rate, around 1 in 10000 bases are misincorporated. A-polymeras som saknar 3 "till 5" exonuclease verksamhet har en högre felfrekvens, runt 1 på 10000 grunderna misincorporated.
Recombinant polymerases have been generated and other polymerases have been isolated which are available to more accurate PCR and have a variety of applications such as sequencing. Rekombinant polymeraser har förekommit och andra polymeraser har varit isolerade som är tillgängliga för mer exakt PCR och har en mängd tillämpningar såsom sekvensering.
Examples of polymerases with 3' to 5' exonuclease activity include: Vent, which is extracted from Thermococcus litoralis , Pfu which is extracted from Pyrococcus furiosus, and Pwo which is extracted from Pyrococcus woesii . Exempel på polymeraser med 3 "till 5" exonuclease verksamhet omfattar: Vent, som utvinns ur Thermococcus litoralis, PFU som utvinns ur Pyrococcus furiosus, och PWO som utvinns ur Pyrococcus woesii.
PCR Polymerase Enzyme Proficiency and PCR Product Size / Length Limitations PCR-polymeras enzym yrkeskunnande och PCR-produkten storlek / längd begränsningar
DNA polymerase are proficient enough to efficiently amplify DNA products up to a few thousand basepairs (2-5 kb). DNA-polymeras är kompetenta nog att effektivt förstärka DNA-produkter upp till några tusen basepairs (2-5 kb). PCRs of longer products are less efficient due to enzyme activity loss, and inaccuracies introduced by longer PCRs. PCRs av längre produkter är mindre effektiva på grund av enzymaktivitet förlust, och felaktigheter som infördes genom längre PCRs. Adding fresh DNA polymerase helps with enzyme activity lost due to the half life of the polymerase, however this does not help when accurate PCR is required. Lägga till nya DNA-polymeras bidrar med enzymaktivitet förlorat på grund av halveringstiden av polymeras, men detta hjälper inte när exakt PCR krävs.
It is possible to amplify PCR products up to 20kb using lower or slower heating cycles and special mixtures of polymerases. Det är möjligt att komplettera PCR-produkter upp till 20kb med hjälp av lägre eller långsammare uppvärmning cykler och särskilda blandningar av polymeraser. Long and Accurate PCR is accomplished by using mixtures of processive polymerases and high fidelity Polymerases. Lång och noggrann PCR sker med hjälp av blandningar av processive polymeraser och High Fidelity polymeraser.