• PCR PCR
• Learn about PCR Läs mer om PCR
• Types of PCR Typer av PCR
• PCR Links PCR Länkar
• PCR News PCR Nyheter
• PCR Troubleshooting PCR Felsökning
• PCR Problems PCR Problem
• PCR Books PCR Böcker
• PCR Forum PCR Forum
• Biology Resouces Biologi resurser
• Tell A Friend Tipsa en vän
• Bookmark Us! Bokmärk oss!
• Advertise on PCR Station! Annonsera på PCR Station!

PCR ENZYMES: PCR Polymerases PCR-enzymer: PCR polymeraser

PCR Polymerases - The Ultimate Guide PCR-polymeraser - The Ultimate Guide

copyright 2006 PCR STATION Copyright 2006 PCR STATION

PCR Polymerases: An Introduction PCR-polymeraser: en introduktion

The choice of the DNA polymerase employed by PCR is determined by the goals of the experiment. Valet av DNA-polymeras är anställda av PCR bestäms av målen för försöket. There are now a plethora of commercially available enzymes to choose from that differ in their thermal stability, processivity, and fidelity. Det finns nu en uppsjö av kommersiellt tillgängliga enzymer att välja på som skiljer sig i deras termisk stabilitet, processivity, och trohet. The most commonly used and most extensively studied enzyme is Taq DNA polymerase. De vanligaste och mest omfattande studerat enzymet Taq DNA-polymeras.

Initial PCR Polymerases Ursprungliga PCR-polymeraser

The DNA polymerases used originally in the first PCR reactions were extracted from the bacterium Escherichia coli . DNA-polymeras används ursprungligen i den första PCR-reaktioner var utvinns från bakterien Escherichia coli. Although this enzyme was an invaluable tool for many molecular biology research uses in the past and even today, it had many disadvantages in the original PCR. Trots detta enzym var ett ovärderligt redskap för många molekylärbiologisk forskning använder i det förflutna och till och med i dag, det hade många nackdelar i den ursprungliga PCR. In PCR, the pcr reaction must be denatured by heating the double-stranded DNA product after each cycle. Unfortunately, heating also irreversibly inactivated the E. coli DNA polymerase. I PCR, PCR-reaktionen måste denatureras genom att hetta upp dubbelsträngat DNA produkt efter varje cykel. Tyvärr, värme också oåterkalleligen inaktiverat de E. coli DNA-polymeras. Fresh aliquots of enzyme had to be added manually at the start of each cycle. Färska alikvoter enzym måste läggas till manuellt i början av varje cykel. With 30-40 cycles of PCR, this was a very laborious and boring task. Med 30-40 cykler av PCR, detta var en mycket tung och tråkig uppgift.

What was required was a DNA polymerase that remained stable during the DNA denaturation step performed at 90°C or hotter. Vad som krävdes var en DNA-polymeras som förblev stabil under DNA denaturering steg utföras vid 90 ° C eller varmare. A discovery made the solution much easier. En upptäckt som gjorts lösningen mycket lättare. The bacterium Thermophilus aquaticus was isolated from water hot springs. Bakterien thermophilus aquaticus var isolerade från vatten Hot Springs. This bacterium was able survive and proliferate in the extremely high water temperatures of the hot springs. Denna bakterie kunde överleva och föröka sig i extremt höga vattentemperaturer i de varma källorna. Isolation of the DNA polymerase from this bacterium yielded a PCR polymerase that was not rapidly inactivated at high temperatures. Isolering av DNA-polymeras från denna bakterie gett en PCR-polymeras som inte snabbt inaktiveras vid hög temperatur. Gelfand et al. Gelfand et al. at Cetus corporation successfully purified and cloned this PCR polymerase now called Taq ( T hermophilus aq uaticus in short) Polymerase. på Cetus Corporation framgångsrikt renat och klonat denna PCR-polymeras nu kallas Taq (T hermophilus aq uaticus inom kort) polymeras.

This allowed a 30-40 cycles of PCR amplification to be performed without the need to open the PCR reaction tube and add fresh polymerase. Detta möjliggjorde en 30-40 cykler av PCR-amplifiering ska utföras utan att behöva öppna den PCR-reaktion röret och tillsätt färska polymeras. This also reduced potential contamination that could be introduced when adding polymerase manually over 20-30 times in the original PCR reactions. Detta har också minskat riskerna för förorening som skulle kunna införas när polymeras manuellt över 20-30 gånger i den ursprungliga PCR reaktioner. Also, due to the nature of the thermophilic bacterium and the polymerase, Taq functioned optimally at temperatures around 72°C, allowing DNA synthesis to be performed at much higher Också, på grund av termofila bakterier och polymeras, Taq fungerat optimalt vid temperaturer runt 72 ° C, vilket gör att DNA-syntesen som skall utföras på mycket högre
temperatures than was possible with the E. coli enzyme. temperaturer än vad som var möjligt med E. coli enzym. This had the advantage of allowing the template DNA strand to be copied at a much higher fidelity due to higher strigency of PCR primer annealing. Detta hade den fördelen att de tillåter mallen DNA strand som ska kopieras på en mycket högre trohet på grund av högre strigency av PCR primer glödgning. This further reduced non-specific products which had affected many earlier PCR reactions. Detta minskas ytterligare icke-specifika produkter som drabbade många tidigare PCR reaktioner.

TAQ DNA Polymerase Taq DNA-polymeras

Taq Polymerase also simply termed "Taq", is a thermostable DNA polymerase used in polymerase chain reaction (PCR) to catalyze the DNA replication reaction in the PCR cycle. Taq-polymeras också helt enkelt kallas "test", är en thermostable DNA-polymeras som används i polymerase chain reaction (PCR) som skall fungera som katalysatorer för DNA-replikation reaktion i PCR-cykeln. In this manner of amplification, PCR is able to examine for the presence or absence of a gene of interest in a biological sample. På så sätt utöka, PCR kan undersöka för närvaron eller frånvaron av en gen av intresse i ett biologiskt prov.

Molecular model of Taq DNA Polymerase. Molekylär modell av Taq DNA-polymeras. Crystal structure of Taq DNA-Polymerase Shows A New Orientation For The Structure-Specific Nuclease Domain. Kristallstruktur av Taq DNA-polymeras visar en ny inriktning för struktur-specifika Nuclease domän.

Taq DNA polymerase replaced E.Coli DNA Polymerase in PCR, due to its thermostable properties. Taq DNA-polymeras ersättas E. coli DNA-polymeras i PCR, på grund av sin thermostable egenskaper. Taq was first isolated from Thermus aquaticus , a bacterium that lives in hot springs and hydrothermal vents. Taq var första isolerade från Thermus aquaticus, en bakterie som lever i varma källor och hydrothermal ventiler.

Taq was the first polymerase that was able to withstand the denaturing conditions (over 90 °C) required during PCR cycling. Taq var det första polymeras som klarar en denaturering villkor (över 90 ° C) krävs under PCR-cykel.

Taq has an e nzymatic halflife at 95°C of about 40 min. Taq har en e nzymatic halflife vid 95 ° C i ca 40 min. For more properties of Taq, see the table below. Mer egenskaper Taq, se tabellen nedan.

One of Taq polymerases' major disadvantages is its low replication fidelity. En av Taq polymeras "stora nackdelar är dess låga replikering trohet. As Taq does not have 3' to 5' exonuclease proofreading mechanism to replace an accidental mismatch in the newly synthesized DNA strand, Taq produces more errors than proofreading polymerases such as Pfu. Som Taq har inte 3 "till 5" exonuclease korrekturläsning mekanism för att ersätta en oavsiktlig obalans i de nytillverkade DNA strand, Taq producerar mer fel än korrekturläsning polymeraser som PFU.

Taq DNA polymerase also is unique in that it produces PCR products with A (Adenine) overhangs. Taq DNA-polymeras också är unik genom att den producerar PCR-produkter med en (Adenin) overhangs. This was found to be quite useful, and was exploited to produce TA Cloning and TOPO cloning (Invitrogen). Detta visade sig vara mycket användbara, och kunde utnyttjas för att producera TA Kloning och TOPO kloning (Invitrogen). These methods employ a cloning vector (or plasmid) which possesses T (Thymine) overhangs. Dessa metoder anställa en kloningsvektor (eller plasmid) som har T (tymin) overhangs. This allows ligation using topoisomerase or DNA ligase to quickly be accomplished with the A overhangs of the PCR product Detta gör det möjligt ligation använder topoisomeras eller DNA Ligase att snabbt bli genomförda med A overhangs av PCR-produkten

PFU DNA Polymerase PFU DNA-polymeras

Pfu DNA polymerase is an enzyme found in the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus, where it functions in vivo to replicate the organism's DNA. PFU DNA-polymeras är ett enzym som finns i hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus, där det fungerar in vivo för att replikera organismens DNA. In vitro, Pfu is used to quickly amplify DNA in the Polymerase Chain Reaction, where the enzyme serves the central function of copying a new strand of DNA during each extension step. In vitro, PFU används för att snabbt förstärka DNA i polymerase chain reaction, där enzymet tjänar den centrala funktionen för kopiering av en ny sträng av DNA vid varje utvidgning steg.

Superiority of Pfu polymerase The main difference between Pfu and alternative enzymes is Pfu's superior thermostability and 'proofreading' properties compared to other thermostable polymerases. Överlägsenhet PFU polymeras Den största skillnaden mellan PFU och alternativa enzymer är PFU överlägsna thermostability och korrekturläsning "egenskaper jämfört med andra thermostable polymeraser. Unlike Taq DNA polymerase, Pfu DNA polymerase possesses 3' to 5' exonuclease proofreading activity, meaning that it works its way along the DNA from the 3' end to the 5' end and corrects nucleotide-misincorporation errors. Till skillnad från Taq DNA-polymeras, PFU DNA-polymeras har 3 "till 5" exonuclease korrekturläsning verksamhet, vilket innebär att man arbetar sig längs DNA från 3 "slut på 5" slutet och rättar nukleotid-misincorporation fel. This means that Pfu DNA polymerase-generated PCR fragments will have fewer errors than Taq-generated PCR inserts. Detta innebär att PFU DNA-polymeras-genereras PCR-fragment kommer att ha färre fel än Taq-genereras PCR införs. As a result, Pfu is more commonly used for molecular cloning of PCR fragments than the historically popular Taq. Som ett resultat av PFU är mer vanligt för molekylär kloning av PCR-fragment än de historiskt populära Taq. Commercially available Pfu typically results in an error rate of 1 in 1.3 million base pairs and can yield 2.6% mutated products when amplifying 1kb fragments using PCR. Kommersiellt tillgängliga PFU vanligtvis resulterar i en felfrekvens av 1 på 1,3 miljoner baspar och kan ge 2,6% muterat produkter när komplettera 1kB fragment med hjälp av PCR. However, Pfu is slower and typically requires 1–2 minutes to amplify 1kb of DNA at 72° C. Using Pfu DNA polymerase in PCR reactions also results in blunt-ended PCR products. Men PFU är långsammare och oftast kräver 1-2 minuter att komplettera 1kB av DNA vid 72 ° C. Med hjälp av PFU DNA-polymeras i PCR reaktioner också resultaten i trubbig fattning PCR-produkter. Pfu DNA polymerase is hence superior for techniques that require high-fidelity DNA synthesis, but can also be used in conjunction with Taq polymerase to obtain the fidelity of Pfu with the speed of Taq polymerase activity. PFU DNA-polymeras är därmed överlägsen för tekniker som kräver high fidelity DNA-syntesen, men kan också användas tillsammans med Taq-polymeras att få Fidelity av PFU med hastigheten på Taq polymeras verksamhet.

History Historia

Scientists associated with the biotech company Stratagene, based in La Jolla, California discovered the superiority of Pfu over Taq in 1991. Forskare i samband med bioteknikföretaget Stratagene, med säte i La Jolla, Kalifornien upptäckte överlägsenhet PFU över Taq 1991. They published their work in the journal Gene in December of that year (Gene. 1991 Dec 12;108(1):1-6). De publicerade sitt arbete i tidskriften Gene i december samma år (Gene. 1991 dec 12, 108 (1) :1-6). US Patent 5,489,523 was granted over exonuclease-deficient Pfu in February 1996 while US Patent 5,545,552 over Pfu itself was granted in August 1996. US Patent 5489523 beviljades under exonuclease-bristfällig PFU i februari 1996 medan US Patent 5545552 över PFU själv beviljades i augusti 1996.

PCR Polymerases PCR-polymeraser

Summary of Available PCR Polymerases and their properties. Sammanfattning av ledig PCR polymeraser och deras egenskaper.

PCR and Polymerases PCR och polymeraser

PCR has been performed on DNA larger than 10 kilobases, however the average PCR is only several hundred to a few thousand bases of DNA. PCR har utförts på DNA större än 10 kilobases dock den genomsnittliga PCR är bara några hundra till några tusen baser i DNA. The problem with long PCR is that there is a balance between accuracy and processivity of the enzyme. Problemet med lång PCR är att det finns en balans mellan noggrannhet och processivity av enzymet. Usually, the longer the fragment, the greater the probability of errors. Vanligtvis är det längre fragment, desto större är sannolikheten för fel.

PCR Polymerases References PCR-polymeraser Referenser

1.

2.

3.

copyright 2006 PCR STATION Copyright 2006 PCR STATION