PCR Product Sequencing PCR-produkten sekvensering
How To Sequence Your PCR Products Hur man sekvens din PCR-produkter
Once you amplify your DNA sequence of interest, you usually need to check the amplification quality and accuracy using DNA sequencing services. När du komplettera din DNA-sekvens av intresse, man behöver för att kontrollera amplifiering kvalitet och noggrannhet med hjälp av DNA-sekvensering tjänster. There are several methods to do this and each method has its advantages and disadvantages. Det finns flera metoder att göra detta och varje metod har sina fördelar och nackdelar.
Direct Sequencing of PCR Products Direkt sekvensering av PCR-produkter
Direct sequencing of PCR products is obviously the quickest method although it is not always the most successful method. Direkt sekvensering av PCR-produkter är naturligtvis den snabbaste metoden även om det inte alltid är den mest framgångsrika metoden. It is possible to directly sequence a PCR product without having first cloned the fragment into a sub-cloning vector such as a TOPO plasmid. Det är möjligt att direkt sekvens en PCR-produkten utan första klonade fragmentet till en sub-kloningsvektor som en TOPO plasmid. Obviously there are many advantages to the direct sequencing approach. Uppenbarligen finns det många fördelar att direkt sekvensering strategi. However, there are several disadvantages and steps which many people bypass only to have failed DNA sequencing results. Det finns dock flera nackdelar och steg som många människor gå förbi bara för att ha misslyckats med DNA-sekvensering resultat.
Direct sequencing of PCR fragments is hardly successful unless you learn how to make it successful. Direkt sekvensering av PCR-fragment är knappast lyckat om du inte lära dig hur man gör det framgångsrikt. We have generated the following tips to make sure you don't fail in your direct sequencing attempts. Vi har genererat följande tips så att du inte misslyckas i din direkt sekvensering försök.
1) Make sure that you have the right PCR product before you send your PCR product for sequencing. 1) Kontrollera att du har rätt PCR-produkten innan du skickar din PCR-produkten för sekvensering.
With sub-cloning PCR products into a vector, people usually restriction enzyme digest the bands out of the vector to check if it is the right sequence. Med sub-kloning PCR-produkter till en vektor, människor i allmänhet begränsning enzym smälta de band av vektorn för att kontrollera om det är rätt ordningsföljd. Make sure you check the size of your PCR product carefully on the gel before you send it for sequencing. Se till att du kontrollerar storleken på din PCR-produkten noggrant på gelen innan du skickar det för sekvensering. Also, if there are known restriction sites in the PCR fragment, make sure you use these to check that your product is the right one. Dessutom, om man vet att det finns begränsningar webbplatser i PCR-fragment, se till att du använder dessa för att kontrollera att produkten är den rätta.
2) Make sure you don't have many non-specific products (bands on agarose gel)! 2) Se till att du inte har många icke-specifika produkter (band på agarosgel)!
PCR reactions rarely produce only a single (one) band. PCR reaktioner sällan producerar bara en enda (en) bandet. Usually you will have many bands (non-specific products). Vanligtvis kommer du att ha många band (icke-specifika produkter). Even if you can't see them, your PCR reaction may have many bands (non-specific products) that will cause your DNA sequencing to have many signals at each nucleotide (you get a jumbled sequence ie N (all 4 nucleotides) instead of 1 nucleotide). Även om du inte kan se dem, din PCR-reaktion kan ha många band (icke-specifika produkter) som kommer att orsaka din DNA-sekvensering att ha många signaler på varje nukleotid (du får en jumbled sekvens dvs N (alla 4 nukleotider) i stället för 1 nukleotid).
Using nested PCR primers can reduce this problem. Använda kapslade PCR-primers kan minska detta problem. It is also less likely that non-specific product will co-amplify through a second round of PCR with internally- Det är också mindre troligt att icke-specifik produkt kommer att co-förstärka genom en andra omgång av PCR med internt -
nested primers. kapslade grundfärg.
3) Remove all residual PCR primers and unincorporated nucleotides before sequencing. 3) Ta bort alla rester av PCR-primers och icke nukleotider innan sekvensering.
The good thing with sub-cloning is that you clone in the PCR fragment into the vector, amplify it, and purify it. Det som är bra med sub-kloning är att du klon i PCR-fragment i vektorn, förstärka den och rena det. This way you have a very clean batch of DNA. Detta sätt du har en mycket ren parti av DNA. After PCR amplification however, you have a lot of unincorporated nucleotides, pcr primers, salts and proteins that can interfere with DNA sequencing. Efter PCR-kopiering, men du har en hel del icke-nukleotider, PCR-primers, salter och proteiner som kan störa DNA-sekvensering. Make sure you at least use a PCR clean-up step to ensure your DNA sequencing doesn't fail. Se till att du åtminstone använda en PCR saneringen steg för att säkerställa din DNA-sekvensering inte misslyckas.
4) Ensure you don't send a very concentrated DNA sample! 4) Se till att du inte skickar en mycket koncentrerad DNA-prov!
Make sure that you double-check the template DNA concentrations before you send your PCR for sequencing. Se till att du dubbelkolla mallen DNA-koncentrationer innan du skickar din PCR för sekvensering. This is because PCR fragments are smaller than plasmids, and thus you get more DNA per sample. Detta beror på PCR-fragmenten är mindre än plasmider, och på så sätt får du fler DNA per prov. This makes PCR products more effective sequencing templates than the usual plasmids. Detta gör PCR-produkter mer effektivt sekvensering mallar än de vanliga plasmider. Therefore you need to have lower concentrations for PCR products. Därför behöver du ha lägre koncentrationer för PCR-produkter.
For example, a 200 bp fragments needs to be just 2 ng/ul! Till exempel, ett 200 bp fragment måste bara 2 ng / Ul! If your samples are at too high a concentration, not only will they NOT sequence any better but may cause your DNA sequencing to fail. Om dina prover på en alltför hög koncentration, inte bara att de inte sekvens något bättre men kan orsaka att din DNA-sekvensering att misslyckas. Estimate your PCR product concentration by loading them with standards on an agarose gel. Beräkna din PCR-produkten koncentration genom att läsa in dem med normer för en agarosgel. Usually laboratory spectrophotometers cannot with accurately measure the small amount of DNA that a PCR reaction generates (unless you use the newer micro-specs ie "Nanodrop"). Vanligtvis laboratorium spectrophotometers kan inte med exakt mäta liten mängd DNA att en PCR-reaktion genererar (såvida du inte använder den nyare mikro-specs dvs "Nanodrop"). Based on your analysis, make sure you dilute them. Baserat på din analys, se till att du späd dem.
Subcloning PCR Products and Sequencing them Subcloning PCR-produkter och sekvensering av dem
The most effective way to sequence PCR products is by subcloning them into vectors or plasmids. Det mest effektiva sättet att sekvens PCR-produkter är av subcloning dem till vektorer eller plasmider. Usually this was done with primers that contained restriction enzyme sites. Vanligtvis gjordes detta med grundfärg som ingår begränsning enzym webbplatser. There were many problems with this including the fact that restriction enzymes have difficulties cutting at the ends of a PCR fragment. Det fanns många problem med detta bland annat det faktum att begränsningen enzymer har svårigheter styckning i ändarna av en PCR-fragment.
After cutting the PCR fragment, one would have to ligate the PCR fragment into a pre-cut vector that has compatible ends. Efter styckning PCR-fragment, ett måste ligate PCR-fragment i en pre-cut vektor som har kompatibla slutar. After amplification and purification of the plasmid, one would simply send the fragment for DNA sequencing. Efter amplifiering och rening av plasmid, en skulle bara skicka fragment för DNA-sekvensering. Most vectors have T7, T3, M13, and other primer sites which allows easy DNA sequencing using universal primers (such as the commonly available T7 primer, T3 primer, and M13 primers). Merparten smittbärare har T7, T3, M13, och andra primer webbplatser som gör det lätt att DNA-sekvensering med hjälp av universella primers (såsom vanliga T7 primer, T3 primer, och M13 grundfärg).
TOPO Vectors for PCR sub-cloning TOPO vektorer för PCR-sub-kloning
The latest greatest innovations allowed many to bypass the difficulties or subcloning PCR products into regular vectors. Den senaste största innovationerna får många att komma förbi de svårigheter eller subcloning PCR-produkter i vanliga vektorer. TOPO cloning allowed the RAPID and easy cloning of PCR products into vectors. TOPO kloning får en snabb och enkel kloning av PCR-produkter till vektorer. TOPO cloning is very quick (5 minutes for ligation) and very effective. TOPO kloning är mycket snabb (5 minuter för ligation) och mycket effektivt. You can easily clone your PCR fragment into the vector without any restriction sites. Du kan enkelt klona din PCR-fragment i vektorn utan begränsningar webbplatser. This is due to the fact that many DNA polymerases add an extra A to the ends of the DNA fragment. Detta beror på det faktum att många DNA-polymeras lägga till en extra A till ändarna på de DNA-fragment. This allowed the cloning of the PCR fragments into TOPO vectors (or TA vectors) which contained free T ends. Detta gjorde det möjligt för kloning av PCR-fragment i TOPO vektorer (eller TA vektorer), som innehöll gratis T slutar. TOPO vectors contain Topoisomerase enzyme which enhances the cloning of PCR fragments into the vector. TOPO vektorer innehålla topoisomeras enzym som förbättrar kloning av PCR-fragment i vektorn.
TOPO vectors are available at Invitrogen TOPO vektorer finns på Invitrogen
Copyright 2006 PCR Station Copyright 2006 PCR Station