PCR Limitations and Disadvantages PCR limitasyon at Disadvantages
The High Sensitivity of PCR Ang mataas na pagkamapagdamdam ng PCR
Due to the extremely high sensitivity of PCR, contamination from non-template PCR present in the lab environment (from bacteria, viruses, and your own DNA) presents a real problem. Dahil sa napakataas na pagkamapagdamdam ng PCR, kontaminasyon mula sa mga di-template PCR sa laboratoryo environment (mula sa bakterya, virus, at ang iyong sariling DNA) na katibayan ng isang tunay na problema. Precautions therefore must be taken. -Iingat sa gayon ay dapat na dadalhin. Several steps can be taken to prevent and minimize PCR contamination including the use of aerosol barrier tip filters, laminar flow cabinet, and a special preparation area for PCR separate from the DNA isolation area. Ilang hakbang ay maaari upang maiwasan at mabawasan ang PCR kontaminasyon kabilang ang paggamit ng erosol barrier dulo ng mga filter, laminar daloy ng gabinete, at paghahanda ng isang espesyal na lugar para sa PCR hiwalay na mula sa DNA isolation area.
Polymerase Errors Polymerase Mali
DNA polymerase are not perfect by any means, however they are quite good at what they do. DNA polymerase ay hindi ganap sa pamamagitan ng anumang paraan, ngunit sila ay lubos na mabuti at kung ano ang kanilang gagawin. Mistakes and errors do happen in PCR by DNA polymerases in the test tube and in the human body. Mga pagkakamali at ang mga error ang nangyari sa PCR sa pamamagitan ng DNA polymerases sa test tube at sa katawan ng tao. The polymerases used in PCR often lack 3' to 5' exonuclease activity such as Taq polymerase. Ang polymerases ginagamit sa PCR madalas kakulangan 3 'sa 5' exonuclease aktibidad tulad ng Taq polymerase. This enzyme lacks the ability to correct misincorporated nucleotides, an activity which is present in higher eukaryotes. Ito enzyme kawalan ng kakayahan sa tamang misincorporated nucleotides, isang aktibidad kung saan ay naroroon sa mas mataas na eukaryotes.
A polymerase lacking the 3' to 5' exonuclease activity has a higher error rate, around 1 in 10000 bases are misincorporated. A polymerase kulang ng 3 'sa 5' exonuclease aktibidad ay may isang mas mataas na rate ng error, sa paligid ng 1 sa 10,000 mga base ay misincorporated.
Recombinant polymerases have been generated and other polymerases have been isolated which are available to more accurate PCR and have a variety of applications such as sequencing. Recombinant polymerases ay nalikha at iba pang mga polymerases ay ilang na kung saan ay magagamit upang mas tumpak ang PCR at magkaroon ng iba't-ibang mga application tulad ng sequencing.
Examples of polymerases with 3' to 5' exonuclease activity include: Vent, which is extracted from Thermococcus litoralis , Pfu which is extracted from Pyrococcus furiosus, and Pwo which is extracted from Pyrococcus woesii . Halimbawa ng polymerases sa 3 'sa 5' exonuclease aktibidad ay ang: ibulalas, na kung saan ay nakuha mula sa Thermococcus litoralis, Pfu na kung saan ay nakuha mula sa Pyrococcus furiosus, at Pwo kung saan ay nakuha mula sa Pyrococcus woesii.
PCR Polymerase Enzyme Proficiency and PCR Product Size / Length Limitations PCR Polymerase Enzyme karunungan at PCR produkto Sukat ng produkto / Length limitasyon
DNA polymerase are proficient enough to efficiently amplify DNA products up to a few thousand basepairs (2-5 kb). DNA polymerase ay sapat na kakayahan sa mahusay na dagdagan DNA produkto hanggang sa loob ng ilang libong basepairs (2-5 KB). PCRs of longer products are less efficient due to enzyme activity loss, and inaccuracies introduced by longer PCRs. PCRs na ng mga produkto ay hindi gaanong mabisa dahil sa enzyme aktibidad ng pagkawala, at ipinakilala sa pamamagitan ng mga kamalian na PCRs. Adding fresh DNA polymerase helps with enzyme activity lost due to the half life of the polymerase, however this does not help when accurate PCR is required. Pagdaragdag ng mga sariwang DNA polymerase ay tumutulong sa enzyme aktibidad nawala dahil sa ang kalahati ng buhay ng polymerase, subalit ito ay hindi tulong kapag tumpak PCR ay kinakailangan.
It is possible to amplify PCR products up to 20kb using lower or slower heating cycles and special mixtures of polymerases. Ito ay posible na palakasin PCR produkto hanggang sa 20kb ang paggamit ng mas mababa o hinaan pagpainit cycles at mga espesyal na mixtures ng polymerases. Long and Accurate PCR is accomplished by using mixtures of processive polymerases and high fidelity Polymerases. Mahaba at Tumpak PCR ay sa pamamagitan ng paggamit ng mixtures ng processive polymerases at mataas na katapatan Polymerases.