PCR酵素： PCR聚合酶
PCR聚合酶-最终指南
版权2006 PCR岗位
PCR聚合酶： 简介
PCR使用的脱氧核糖核酸聚合酶的选择取决于实验的目标。 现在有选择的过多商业可用的酵素从该有所不同在他们的耐热性、processivity和保真度。 最常用和最广泛地被学习的酵素是Taq脱氧核糖核酸聚合酶。
最初的PCR聚合酶
在第一种PCR回应原来地使用的脱氧核糖核酸聚合酶从细菌大肠埃希氏菌被提取了。 虽然此酵素是为许多的一个无价的工具分子生物学研究以前使用，并且甚而今天，它有许多缺点在原始PCR。 在PCR，必须通过加热双股的脱氧核糖核酸产品弈质pcr回应在每个循环以后。 不幸地，也加热不可逆转地撤销了大肠埃希氏菌脱氧核糖核酸聚合酶。 新整除数酵素必须在每个循环的开始手动地被添加。 PCR的30-40个循环，这是一项非常费力和乏味任务。
需要什么是脱氧核糖核酸聚合酶保持稳定在脱氧核糖核酸变性步骤期间执行在90°C或摇动。 发现使解决方法更加容易。 细菌适温的aquaticus与水温泉查出。 此细菌能生存并且激增在温泉的非常水位高温度。 脱氧核糖核酸聚合酶的隔离从此细菌的产生未迅速地被撤销在高温的PCR聚合酶。 Gelfand在Cetus公司顺利地等净化了并且克隆了此PCR聚合酶现在叫的Taq (适温的aquaticus简而言之)聚合酶。
这准许PCR放大作用的30-40个循环将执行的，不用需要打开PCR回应管和添加新鲜的聚合酶。 可能引入，当手动地添加聚合酶20-30时的此也减少的潜在的污秽在原始PCR回应计时。 并且，由于喜温的细菌和聚合酶， Taq的本质最佳地发挥作用在温度在72°C附近，允许脱氧核糖核酸综合执行在更高
温度比对大肠埃希氏菌酵素可能的。 这有允许模板脱氧核糖核酸子线的好处被复制在高精度由于PCR初级读本焖火更高的strigency。 此影响许多更早的PCR回应的进一步减少的未指明的产品。
TAQ脱氧核糖核酸聚合酶
也Taq聚合酶被命名的“Taq”，是用于聚合酶链反应的一个耐高温的脱氧核糖核酸聚合酶(PCR)摧化在PCR循环的脱氧核糖核酸副本回应。 照此放大作用， PCR能为出现或缺乏兴趣基因检查在一个生物范例上。
Taq脱氧核糖核酸聚合酶分子设计。 Taq脱氧核糖核酸聚合酶晶体结构显示结构特定核酸酶域的一个新的取向。
Taq脱氧核糖核酸聚合酶替换了大肠埃希氏菌在PCR的脱氧核糖核酸聚合酶，由于其耐高温的属性。 Taq与Thermus aquaticus，在温泉和热水出口居住的细菌首先查出。
Taq是能承受弈质适应的第一个聚合酶(90在PCR循环期间需要的°C)。
Taq有e nzymatic半衰期在大约40 min. 95°C。 关于Taq更多属性，参见下面表。
其中一个Taq聚合酶的主要缺点是其低副本保真度。 因为Taq没有3 '到5 ' exonuclease校对结构替换在最近被综合的脱氧核糖核酸子线的偶然配错， Taq比校对聚合酶导致更多错误例如Pfu。
Taq脱氧核糖核酸聚合酶也是唯一的因为它生产PCR产品以A (腺嘌呤)突出物。 发现这相当有用的和被剥削导致TA克隆和TOPO克隆(Invitrogen)。 这些方法使用拥有T的克隆向量(或质粒) (胸腺嘧啶)突出物。 这允许结扎术使用topoisomerase或脱氧核糖核酸连接酶迅速完成以PCR产品的A突出物
PFU脱氧核糖核酸聚合酶
Pfu脱氧核糖核酸聚合酶是在hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus找到的酵素，它发挥作用体内复制有机体的脱氧核糖核酸。 体外， Pfu被用于迅速放大在聚合酶链反应的脱氧核糖核酸，在每个扩展名步骤期间，酵素发挥复制脱氧核糖核酸一条新的子线的中心职能。
Pfu聚合酶优势Pfu和替代酵素之间的主要区别是Pfu的优越热稳定性和‘校对’属性与其他耐高温的聚合酶比较。 不同于Taq脱氧核糖核酸聚合酶， Pfu脱氧核糖核酸聚合酶拥有3’到5’校对活动的exonuclease，意味它运作其沿脱氧核糖核酸的方式从3’结尾到5’末端并且更正核苷酸misincorporation错误。 这意味着Pfu脱氧核糖核酸聚合酶被生成的PCR片段比Taq被生成的PCR插入将有少量错误。 结果， Pfu为PCR片段分子克隆比历史上普遍的Taq通常使用。 当放大1kb片段使用PCR时，商业可用的Pfu典型地导致误差率的1在1.3百万个基本对，并且可能产生2.6%变化的产品。 然而， Pfu是更慢的和典型地需要1-2分钟放大脱氧核糖核酸1kb在72° C。 使用Pfu在PCR回应的脱氧核糖核酸聚合酶也导致直言结束的PCR产品。 因此Pfu脱氧核糖核酸聚合酶是要求高保真度的脱氧核糖核酸综合的技术的主管，但是可能与Taq聚合酶一道也使用获得Pfu的保真度与Taq聚合酶活动的速度的。
历史记录
科学家联合生物科技公司Stratagene，根据在La Jolla，在1991年加利福尼亚发现了Pfu优势在Taq的。 他们在12月该年发布了他们的在日记帐基因的工作(基因。 12月1991日12日; 108 (1) ：1-6)。 美国，当在Pfu的美国专利5,545,552在1996年时， 8月被授予了专利5,489,523被授予了在exonuclease短少Pfu在2月1996日。
PCR聚合酶
可用的PCR聚合酶和他们的属性汇总。
脱氧核糖核酸聚合酶 |
生物来源 |
5 '--3 ' Exonuclease 活动 |
3 '--5 ' Exonuclease 活动 |
95°C半衰期(分钟) |
广告名称 |
供应的公司 |
扩展名费率(nucleosides/s) |
误差率 |
时间(s)对1kb (72°C) |
Taq |
Thermus Aquaticus |
+ |
- |
40 |
AmpliTaq， AmpliTaq金子 |
Promega、Roche， Invitrogen和许多其他。 |
75 |
1在10^3 |
32 |
Pfu |
Pyrococcus furiosus |
- |
+ |
120 |
PfuTurbo |
Stratagene， Fermentas， Invitrogen除了别的以外
|
60 |
1在1.3 x 10^6 |
60-120 |
Pwo
|
Pyrococcus woesei |
- |
+ |
N/A |
N/A |
N/A |
N/A |
||
Tfl |
Thermas flavus |
- |
- |
||||||
rTth |
适温的Themus |
+ |
- |
20 |
|||||
Tli |
Thermus litoris |
- |
+ |
400 |
出气孔 |
||||
Tma |
Thermotoga maritima |
- |
+ |
>50 |
|||||
PCR和聚合酶
PCR在脱氧核糖核酸执行大于10 kilobases，然而平均PCR只是数百对脱氧核糖核酸几千个基础。 长的PCR的问题是有在酵素的准确性和processivity的之间一个平衡。 通常，越长片段，越极大误差概率。
PCR聚合酶参考
1.
2.
3.
版权2006 PCR岗位