PCR 克隆
克隆PCR 產品
如果您想要克隆DNA 的片段入質粒或修建, 最容易的方式的當中一個做這使用PCR 。如果您有DNA 片段或基因已經在質粒, 並且制約站點側片段是與您想要克隆它入的新質粒兼容, 制約酵素消化通常運作得很好。
但是, 如果您想要設計新制約站點為片段, 修建刪除片段, 或改變站點在DNA 之內, DNA 片段的PCR 或polymerase 鏈式反應是最容易和最佳的方式的當中一個克隆您的片段使用PCR 。
設計底漆為PCR 克隆
底漆為PCR 克隆通常是長的由於需要增加制約站點。
制約站點通常是6 bp 在長度。如果您沒去subclone PCR 產品, 您需要增加nucleotides 5' 制約站點
這允許制約酵素束縛對和切開制約站點是更加高效率的。
間隔號制約站點底漆序列(由更加雷管的節目設計)
3 bp -- 6bp -- 15-22 bp
PCR Subcloning
(Subclone 意味克隆PCR 產品入傳染媒介在您插入它入您的傳染媒介利益之前。這的好處包括事實您再從未必須PCR 您的插入物, 您總將有它在冰箱, 並且您能長大儘量您要使用細菌。)
從我們的經驗, 切開PCR 產品比切口片段通常較不高效率的在傳染媒介外面。因而, 切開的PCR 產品和克隆他們入高效率和您可以把麻煩做這的您的傳染媒介不能直接地是。
那是方式subcloning 入subcloning 的傳染媒介通常是最佳。
TOPO 傳染媒介
TOPO 傳染媒介是偉大的為subcloning, 雖然他們能是昂貴的。他們從長遠看將保存您時間, 和使克隆PCR 產品更加容易和更加高效率。
這的原因是, 您能容易地消化DNA 在質粒。它是高效率的為制約酵素因為它可能容易地束縛對和消化您的片斷。
不利是, 您必須有高效率和優化PCR 情況。許多帶出現在您的PCR 將使它困難如果不不可能克隆您的PCR 產品利益。
您通常能subclone 您的PCR 產品在大約2 天內。結紮術需要只5 分鐘並且您能鍍您的細菌殖民地結紮術的天。一旦您次日採摘殖民地和生長他們在媒介, 您不僅放大您的插入物, 您現在並且有細菌殖民地您subcloned 您能冷凍與丙三醇入液氮幾年來的插入物。
這真正地幫助當您需要做其它修建與您的插入物!